一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因PnF3H及其应用

本发明属于分子生物，具体涉及一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnf3h及其应用。

背景技术：

1、类黄酮(flavonoids)化合物是一类在植物中发现的天然多羟基酚类次生代谢物质，广泛分布于植物界，具有很高的生物活性。类黄酮作为植物体内天然合成的重要次生代谢产物，与植物叶片、茎秆和花的颜色发育密切相关。此外，类黄酮化合物现如今已经被广泛认为是植物化学物质中的一大类活性成分，在植物的生长、发育、繁殖和对多种压力的反应上有多样的功能，并且类黄酮化合物还在动物的生长发育、医学发展以及人类健康等方面都发挥着不可忽视的关键性作用。有关研究发现天然存在的类黄酮化合物具有很多包括抗菌、抗氧化、抑菌、抗癌等有益的生理活性和功能作用。

2、类黄酮化合物的基本结构：两个苯环之间由含有3碳的吡喃环与15碳苯丙烷环相连接形成一个核心的c骨架结构。该骨架可在不同酶的酰基化、甲氧基化、羟基化或o-糖基化形成不同的种类，具体可分为六大类，分别是黄酮醇(flavonols)、花青素(anthocyanidins)、黄酮(flavones)、黄烷酮(flavanones)、异黄酮(isoflavones)和黄烷醇(flavanols)。

3、苯丙氨酸代谢途径是类黄酮物质生物合成是的主要过程，一般是从苯丙氨酸代谢开始，进入类黄酮物质的生物合成分支。首先，苯丙氨酸通过苯丙氨酸裂解酶(phenylalanine ammonia-lyase,pal)的脱氨基作用生成肉桂酸，肉桂酸4-羧化酶(cinnamate 4-hydroxylase,c4h)可在肉桂酸的苯环上引入羟基产生香豆酸，其次在香豆酰辅酶a连接酶的作用下，将香豆酸催化成香豆酰辅酶a。香豆酰辅酶a和丙二酰辅酶a在查尔酮合酶(chalcone synthase,chs)和查尔酮异构酶(chalcone isomerase,chi)的催化下生成类黄酮生物合成的重要前体物质柚皮素(naringenin)。随后，柚皮素作为主要代谢产物，进入其他类黄酮的合成途径，经过黄烷酮-3-羧化酶(flavanone-3-hydroxylase,f3h)、黄烷酮-3′-羟化酶(flavone-3′-hydroxylase,f3′h)和黄酮醇合酶(flavonol synthase,fls)等酶的催化，最终生成黄酮、异黄酮、黄酮醇以及花青素的前体。

4、黄烷酮-3-羧化酶(f3h)是植物花青素生物合成途径上的关键酶基因，主要负责将柚皮素催化成二氢黄酮醇，在植物体内普遍存在。然而，现有技术中还未报道过紫竹类黄酮化合物合成相关基因f3h及其用途。

5、综上所述，对参与类黄酮合成的类黄酮合成途径中f3h基因的研究有助于了解类黄酮合成的机理，也为了解竹子秆色发育的分子机制研究奠定基础。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnf3h及其应用的技术方案。

2、本发明是通过以下技术方案实现：

3、本发明第一方面提供了一种紫竹类黄酮化合物合成的相关基因pnf3h，该核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明第二方面提供了上述的一种紫竹类黄酮化合物合成的相关基因pnf3h的编码蛋白，该蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、本发明第三方面提供了含有上述的一种紫竹类黄酮化合物合成的相关基因pnf3h的载体。

6、本发明第四方面提供了上述的一种紫竹类黄酮化合物合成的相关基因pnf3h或上述的载体在调控类黄酮化合物合成中的应用。

7、进一步，所述的应用，使植物包含基因pnf3h或使植物过表达基因pnf3h。

8、本发明第五方面提供了一种调控植物类黄酮化合物合成的方法，该方法为：使植物包含基因pnf3h或使植物过表达基因pnf3h。

9、进一步，所述的方法，具体包括以下步骤：

10、1)采集一年生紫竹叶片，进行rna提取，反转录成cdna，克隆出pnf3h的cds序列，再将其连接pc-1300gfp载体进行测序，鉴定正确后构建35s::pnf3h过表达载体；

11、2)将构建的35s::pnf3h过表达载体转入植物愈伤组织中，使植物包含基因pnf3h或使植物过表达基因pnf3h。

12、本发明具有以下有益效果：

13、1、本发明首次从紫竹中获得pnf3h基因以及编码蛋白，并验证了其调控类黄酮合成的生物学功能。

14、2、本发明首次将紫竹pnf3h基因在烟草和马来甜龙竹的愈伤中过量表达，运用pcr方法证明该基因已成功整合到烟草基因组和马来甜龙竹的愈伤中，即阳性株系。

15、3、本发明对转基因烟草叶片、野生型烟草叶片、普通的马来甜龙竹愈伤组织和转基因马来甜龙竹愈伤组织的cdna为模板进行qrt-pcr分析，并且测定pnf3h转基因烟草与马来甜龙竹愈伤中类黄酮含量，结果表明过表达pnf3h的转基因株系中，烟草类黄酮合成途径中大部分基因的表达量被上调但不显著，推测pnf3h在烟草类黄酮合成中可能发挥一定的作用。在过表达pnf3h的马来甜龙竹的转基因愈伤中，pnf3h转基因马来甜龙竹不同株系中类黄酮合成途径关键基因的表达水平被提高，推测pnf3h在竹子类黄酮合成过程中可能发挥一定的作用。

技术特征：

1.一种紫竹类黄酮化合物合成的相关基因pnf3h，其特征在于：该核苷酸序列如seq idno.1所示。

2.如权利要求1所述的一种紫竹类黄酮化合物合成的相关基因pnf3h的编码蛋白，其特征在于：该蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.含有权利要求1所述的一种紫竹类黄酮化合物合成的相关基因pnf3h的载体。

4.如权利要求1所述的一种紫竹类黄酮化合物合成的相关基因pnf3h或权利要求3所述的载体在调控类黄酮化合物合成中的应用。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：使植物包含基因pnf3h或使植物过表达基因pnf3h。

6.一种调控植物类黄酮化合物合成的方法，其特征在于：使植物包含基因pnf3h或使植物过表达基因pnf3h。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

技术总结
一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因PnF3H及其应用，属于分子生物技术领域。本发明一方面提供了类黄酮化合物合成相关基因PnF3H以及其编码蛋白，另一方面提供了类黄酮化合物合成相关基因PnF3H的用途。本发明提供了一种紫竹重要的并且可能具有普适性的调控类黄酮合成的基因资源，为培育竹子秆色变化的植物品种提供了优秀的候选基因。

技术研发人员：林新春,侯丹,曹雅聃,黄芝诺,张朋威
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15