基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用

本发明涉及一株基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用，本发明属于生物制品。

背景技术：

1、近年来，禽呼肠孤病毒(avian reovirus，arv)感染呈上升趋势，该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡均可感染，该病常引起混合感染或继发感染，死亡率高达30％～50％，给我国肉鸡养殖业带来巨大经济损失。

2、arv是无囊膜的dsrna病毒，其基因组由10个节段组成，与其他基因节段相比，s1基因片段中的σc基因的非同义替换率高于同义替换率，说明σc基因及其编码蛋白的进化速率高于其他基因节段。因此，σc基因常作为arv流行毒株分型的依据，根据其遗传进化分析，arv毒株可分为6种基因型，当前市售疫苗株均来源于基因ⅰ型毒株(如s1133、1733和2408)。

3、疫苗免疫是防控该病的有效途径，然而长期的疫苗免疫压力及现行的集约化养殖密度导致arv变异株不断出现，有研究报道，当前市售疫苗并不能为这些变异毒株提供完全免疫保护。因此，亟待开展我国当前arv变异株流行情况调查，了解其生物学特征和致病特点，为arv综合防控提供指导。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一株基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株；

2、本发明的目的之二在于提供该基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株在制备灭活疫苗中的应用。

3、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

4、2020年，在江苏省某肉鸡企业(已接种市售arv疫苗)中，多批已产生高水平arv抗体的商品肉鸡仍出现跛行、跗关节肿胀/变形等典型arv特征症状，本发明发明人利用lmh细胞(leghorn male chicken hepatocellular carcinoma，lmh)成功分离到了一株禽呼肠孤病毒株(arv-js20-9304)，并揭示了其生物学特性和遗传特征。σc基因遗传进化分析显示，本发明分离的arv-js20-9304株为arv变异株，与已报道的基因ⅳ型参考株avs-b和k1600657同源性最高，处于同一进化分支，而与arv其它基因型毒株同源性较低；与疫苗株s1133核苷酸序列及其编码氨基酸序列同源性分别为55.5％和49.2％，提示该分离毒株与市售疫苗株之间存在较大的抗原变异。据报道，当毒株和疫苗毒株之间的氨基酸差异达到或超过5％时，交叉保护作用就会减弱。本发明鉴定的arv-js20-9304变异株与当前使用商品化疫苗毒株s1133主要保护性抗原σc基因编码的氨基酸序列同源性较低，存在明显的抗原性差异，我们通过进一步的攻毒保护试验，验证该变异株已逃逸现有疫苗的保护。lmh细胞传代培养结果表明，该变异株能够在lmh细胞上良好增殖，产生典型的细胞融合病变，病毒复制滴度较高，感染后60h可达到107.0tcid50/100μl以上。该变异株对鸡胚和spf雏鸡均具有明显的致病性，可引起接种鸡胚在5天内全部死亡，接种1日龄spf雏鸡100％发病，爪垫红肿呈紫红色，75％鸡只出现死亡。当前市售疫苗对于本次分离的基因ⅳ型毒株arv-js20-9304保护效果较差，不能提供完全保护。本发明将分离得到的arv-js20-9304毒株制备灭活疫苗免疫spf鸡，攻毒后连续观察10天，每日观察鸡只临床症状并记录发病情况。实验结果发现，灭活疫苗免疫组在整个观察期内，鸡只未出现任何发病状态，所有鸡只精神状态良好，爪垫也未出现任何肿胀状态；而攻毒对照组在攻毒后2天开始发病，发病持续整个观察期，发病鸡表现为精神萎靡、食欲减退以及爪垫严重肿胀等临床症状，随着感染时间延长，部分鸡出现跛行、无法站立等现象。以上结果表明，arv-js20-9304毒株制备灭活疫苗可为同基因型强毒提供完全保护，该毒株有望作为当前鸡呼肠孤病毒新基因型疫苗储备研究的候选疫苗株。

5、在上述研究的基础上，本发明提出了一株基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株，命名为arv-js20-9304，分类命名为禽呼肠孤病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：cgmcc no.45564，保藏时间为：2023年4月25日。

6、进一步的，本发明还提出了所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株在制备预防禽呼肠孤病毒病药物中的应用。

7、其中，优选的，所述的药物为禽呼肠孤病毒灭活疫苗。

8、再进一步的，本发明还提出了一种禽呼肠孤病毒灭活疫苗，所述灭活疫苗的有效成分为灭活后的本发明所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株。

9、更进一步的，本发明还提出了一种制备所述的禽呼肠孤病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

10、向所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株的f6代病毒培养液中，加入1‰体积比的甲醛，混合均匀，置于37℃，每1h转动混匀1次，放置24h，得到灭活病毒液；将5％吐温-80与灭活病毒液按照体积比1：20混匀，混匀后再与白油按体积比1:1.5乳化，乳化的具体操作为：先把白油加入乳化瓶中乳化30s，再沿着乳化头缓慢加入病毒混合液，注意不要产生气泡。乳化器调到6档，乳化3min/次，重复三次，乳化后的样品滴至水中，乳化滴5-10s不散开即可。

11、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

12、本发明从我国江苏省某企业送检的病鸡关节组织中成功分离到1株禽呼肠孤病毒，将其命名为arv-js20-9304，该毒株纯净性良好。σc基因遗传进化分析结果表明，该分离病毒位于arv基因ⅳ型分支，与基因ⅳ型参考毒株k1600657和avs-b遗传距离较近，氨基酸序列同源性分别为81.7％和79.2％，而与其他基因型分离毒株遗传距离较远。该分离毒株在lmh细胞上增殖良好；对鸡胚和雏鸡均具有明显的致病性，可引起接种鸡胚100％死亡，接种1日龄spf雏鸡100％死亡，其中感染后第4d，spf鸡全部死亡，当前市售疫苗对于其保护效果较差，不能提供完全保护。将本发明分离得到的arv-js20-9304毒株制备灭活疫苗免疫spf鸡，攻毒后连续观察10天，每日观察鸡只临床症状并记录发病情况。实验结果发现，灭活疫苗免疫组在整个观察期内，鸡只未出现任何发病状态，所有鸡只精神状态良好，爪垫也未出现任何肿胀状态，表明arv-js20-9304毒株制备灭活疫苗可为同基因型强毒提供完全保护。因此，本发明的提出为当前鸡呼肠孤病毒新基因型疫苗储备研究提供了新的候选疫苗株，同时也为了解我国arv变异株的流行及遗传进化特征提供了重要的理论依据。

技术特征：

1.一株基因ⅳ型禽呼肠孤病毒(avianreovirus，arv)变异株，命名为arv-js20-9304，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmccno.45564。

2.权利要求1所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株在制备预防禽呼肠孤病毒病药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为禽呼肠孤病毒灭活疫苗。

4.一种禽呼肠孤病毒灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗的有效成分为灭活后的权利要求1所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株。

5.一种制备权利要求3所述的禽呼肠孤病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一株基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用。所述的基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株，命名为ARV‑JS20‑9304，其保藏号为：CGMCCNO.45564。将本发明分离得到的ARV‑JS20‑9304毒株制备灭活疫苗免疫SPF鸡，攻毒后连续观察10天，每日观察鸡只临床症状并记录发病情况。实验结果发现，灭活疫苗免疫组在整个观察期内，鸡只未出现任何发病状态，所有鸡只精神状态良好，爪垫也未出现任何肿胀状态，表明ARV‑JS20‑9304毒株制备灭活疫苗可为同基因型强毒提供完全保护。本发明的提出为当前鸡呼肠孤病毒新基因型疫苗储备研究提供了新的候选疫苗株，同时也为了解我国ARV变异株的流行及遗传进化特征提供了重要的理论依据。

技术研发人员：高立,高玉龙,李凯,刘长军,祁小乐,张艳萍,崔红玉,王素艳,陈运通
受保护的技术使用者：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15