一种在活细胞表面选定位点原位聚合高分子的方法

一、本发明涉及一种在活细胞表面选定位点原位聚合高分子的方法。

背景技术：

0、二、背景技术

1、活细胞表面工程是在保持细胞活性的前提下，使用化学、生物学、材料科学等方法工程化细胞，以实现对活细胞表面基团、性质和功能的人为操控。人造高分子不仅是最容易实现对天然大分子结构和功能进行模拟的物质形态，还可以通过调节单体实现天然大分子难以实现的功能。利用人造大分子工程化活细胞，可以为理解复杂生物系统的结构及其生理功能提供丰富的模型，推进人体细胞和组织的工程化研究，创建新的基于活细胞的疾病治疗方法。

2、在活细胞表面，传统的高分子工程化方法是将合成好的高分子通过脂质插入、静电吸附、共价连接等方式结合到细胞表面。这些方法的问题在于，聚合物和细胞表面分子的空间位阻会导致连接效率低，无法在细胞选定位点实现高分子的高效精准接枝。这会影响合成高分子在细胞表面发挥预设的调控功能。

3、为解决这个问题，本发明开发了一种在活细胞表面选定位点原位引发氧化还原型可控自由基聚合的方法。通过代谢标记技术在活细胞表面的蛋白、脂质或聚糖等选定位点引入生物正交反应基团，以介导链转移剂在指定位点的锚定，进一步引发超快芬顿-可逆加成断裂链转移(fenton-raft)聚合，在活细胞的不同生物位点原位生长高分子。本方法对发展细胞和组织工程化技术，以及基于细胞的疾病疗法具有重要意义。

技术实现思路

0、三、
技术实现要素：

1、本发明的目的是开发一种在活细胞表面选定位点原位聚合高分子的方法。

2、为精准控制聚合物的生长位点，本发明利用生物正交的点击反应基团修饰的代谢标记试剂可以参与细胞内特定合成通路的性质，实现细胞特定生物位点的共价标记。该标记可以通过点击化学反应连接互补基团修饰的链转移剂(cta)，实现cta在细胞膜上选定生物位点的锚定。将锚定了cta的活细胞与含有单体、游离cta和过氧化氢的溶液混合后，加入少量硫酸亚铁铵启动fenton-raft反应，聚合2分钟后通过将反应体系暴露在空气中并稀释溶液来终止聚合反应。聚合后细胞活性维持在95％以上。在聚合体系中同时加入烯基单体和功能性单体，即可在活细胞表面选定位点实现原位共聚。

3、本发明通过以下技术方案来实现：

4、1)如图1所示，将叠氮修饰的代谢标记试剂加入细胞培养液，培养细胞一定时间后，即可在细胞选定位点引入叠氮修饰。以1，3，4，6-四-o-乙酰基-n-叠氮乙酰基氨基甘露糖(ac4mannaz)、1，3，4，6-四-o-乙酰基-2-[(叠氮乙酰基)氨基]-2-脱氧-β-d-吡喃半乳糖(ac4galnaz)、l-叠氮高丙氨酸盐酸盐(aha)和1-叠氮乙基胆碱(aecho)作为代谢标记试剂，可以分别在细胞表面的唾液酸(聚糖)、n-乙酰半乳糖胺(聚糖)，蛋氨酸(蛋白质)和胆碱(脂类)上引入n3基团。

5、2)通过二苯并环辛炔(dbco)的氨基与链转移剂2-{[(丁基磺酰基)碳硫酰基]磺酰基}丙酸(btpa)的羧基反应合成dbco修饰的链转移剂(dbco-btpa)。将在选定位点修饰叠氮的细胞与dbco-btpa温育1h，利用无铜点击化学反应将dbco-btpa共价连接到细胞选定位点的n3基团上，实现链转移剂在活细胞表面选定位点的锚定。

6、3)将锚定了btpa的活细胞与含有单体、游离btpa和过氧化氢的溶液混合，通过注入硫酸亚铁铵(fe2+)溶液启动fenton-raft聚合。聚合体系各组分的比例为[单体]∶[btpa]∶[h2o2]∶[fe2+]＝80∶1∶0.3∶0.1。反应2分钟后将反应体系暴露在空气中并稀释溶液以终止聚合反应。

7、与现有技术相比，本发明具有以下特点：

8、提出了一种在活细胞表面选定位点原位聚合高分子的方法。相比于现有基于聚合物的活细胞表面工程化方法：

9、(1)本发明首次在活细胞表面实现了生长位点可控的高分子聚合。通过在不同位点生长高分子，可以精准调控工程化细胞的识别特性。

10、(2)提出了利用代谢标记技术在活细胞表面共价锚定链转移剂的策略，减少了对细胞不必要的干扰，提高了聚合物修饰的稳定性。

11、(3)发展了一种细胞原位引发的可控自由基聚合方法，速度极快，仅需两分钟即可完成。相比于将合成好的聚合物接枝到细胞表面的方法，本发明突破了来源于细胞表面大分子和人工高分子量聚合物的空间位阻，有效提高了接枝效率。

12、(4)聚合后细胞的活性，增殖能力，细胞骨架，细胞内活性氧、蛋白和dna表达水平，新陈代谢能力，细胞自身功能都得到很好的保持。

13、(5)本发明适用于各种烯类单体，可通过共聚不同种类的单体在活细胞表面灵活定制不同功能的聚合物。

技术特征：

1.一种在活细胞表面选定位点原位聚合高分子的方法，其特征为利用代谢标记技术在细胞表面选定生物位点(蛋白、脂类、聚糖)共价修饰叠氮基团，再通过点击化学反应将链转移剂连接到叠氮基团，然后引发芬顿-可逆加成断裂链转移聚合反应，在活细胞表面选定位点生成高分子。

2.根据权利要求1所述的在活细胞表面选定位点原位聚合高分子的方法，其特征为可以通过选择叠氮修饰的不同代谢标记试剂，在细胞的不同生物分子位点，包括氨基酸、胆碱、糖，原位生成高分子。

3.根据权利要求1所述的在活细胞表面选定位点原位聚合高分子的方法，其特征在于，通过代谢标记技术在细胞选定位点引入的叠氮基团可以在生理缓冲液中与二苯并环辛炔修饰的链转移剂发生点击化学反应，实现链转移剂在活细胞表面选定位点的共价锚定。

4.根据权利要求1所述的在活细胞表面选定位点原位聚合高分子的方法，其特征在于，在无氧条件下将在选定位点锚定链转移剂的活细胞与含单体、游离链转移剂和过氧化氢的溶液混合，然后加入硫酸亚铁铵，即可启动芬顿-可逆加成断裂链转移聚合反应，在活细胞的选定位点生长高分子。

5.根据权利要求1所述的在活细胞表面选定位点原位聚合高分子的方法，其特征在于，利用该方法可以在活细胞表面均聚烯类单体或与功能性单体共聚，在活细胞表面生成均聚物或功能性共聚物。

技术总结
本发明涉及一种在活细胞表面选定位点原位聚合高分子的方法，该方法利用代谢标记技术在活细胞特定生物位点(如蛋白、脂类、聚糖)引入生物正交的点击反应基团，再通过点击化学反应将链转移剂(CTA)共价连接在细胞膜上选定的生物位点上，将锚定了CTA的活细胞与含有单体、游离CTA和过氧化氢的溶液混合，再加入硫酸亚铁铵启动芬顿‑可逆加成断裂链转移(Fenton‑RAFT)聚合反应，即可在活细胞的选定位点生长高分子，该发明在细胞疗法，组织工程，再生医学，药物递送以及生物传感和生物成像等多个领域具有巨大的应用潜力。

技术研发人员：丁霖,鞠熀先,钟艺红,许丽佳,郭玉娜
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/30