索罗金小球藻金黄色突变株FZU60-MT03及其应用

本发明涉及微藻优势藻株的突变体筛选领域，具体涉及一株索罗金小球藻金黄色突变株fzu60-mt03及其在高效联产蛋白质和叶黄素中的应用。

背景技术：

1、索罗金小球藻(chlorellasorokiniana)是一种单细胞绿藻，具有生长速度快、能适应宽广的环境和培养条件等特点。由于索罗金小球藻可实现超高密度异养培养，因此在诸如油脂、蛋白质、叶黄素等生产方面展现出了巨大的商业应用潜力，近年来引起了广泛的科学和商业兴趣。

2、前期我们利用一株索罗金小球藻chlorellasorokinianafzu60可实现高密度异养联产蛋白质和叶黄素(一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，专利申请号202211110076.0)。然而，野生型索罗金小球藻在异养条件下还可积累叶绿素，这也使得其具有浓重的青草味且呈深绿色。据报道，当前微藻在食品中的应用还面临着一些挑战，主要是由于它们的感官特征，包括强烈的绿色、青草味等，因此消费者的感官接受度普遍较低。此外，在已报道的微藻叶黄素的提取制备工艺中往往需要额外的皂化等步骤，而微藻蛋白质的提取制备则需要脱色、脱腥等步骤，这也主要是由于藻粉中的叶绿素含量过高所导致的。因此，为提高微藻基食品的感官接受度，以及简化微藻叶黄素及蛋白质的提取制备工艺，有必要进一步开发筛选不合成叶绿素且可积累高含量叶黄素和蛋白质的微藻种质，但目前尚未有相关研究报道。由于随机诱变不会引入外源基因，因此采用该手段对生产藻种进行遗传改良，从根本上抑制叶绿素的合成同时增强叶黄素和蛋白质的积累可能是一种更为有效的途径。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一株索罗金小球藻金黄色突变株fzu60-mt03及其在高效联产蛋白质和叶黄素中的应用。由于突变株fzu60-mt03在异养条件下不合成叶绿素，且细胞内可积累更高的叶黄素和蛋白质含量，使其细胞呈现金黄色。本发明突变株fzu60-mt03可通过异养发酵高效联产蛋白质和叶黄素，不仅可简化后期叶黄素和蛋白质的提取制备工艺，还可改善藻粉的感官接受度，为微藻叶黄素和微藻蛋白质的产业化生产及应用提供优质种质资源。

2、为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：

3、本发明优选通过化学试剂甲基磺酸乙酯来诱变筛选获得叶绿素合成缺陷型的索罗金小球藻金黄色突变株fzu60-mt03。

4、本发明在前期专利申请202211110076.0所要求保护的索罗金小球藻(chlorellasorokiniana)藻株fzu60(保藏号：cgmccno.45230)的基础上，对其诱变筛选得到多个在异养条件下叶绿素合成缺陷型的索罗金小球藻金黄色突变株。经培养实验验证，个别突变株还具有蛋白质和叶黄素含量高的特点。

5、所述突变株fzu60-mt03在异养发酵条件下几乎检测不出叶绿素含量，同时蛋白质和叶黄素含量分别约为野生型藻株的1.50倍和1.26倍。

6、本发明进一步将筛选获得的索罗金小球藻金黄色突变株fzu60-mt03进行保藏，其保藏编号为cgmccno.40457，分类命名为淡水小球藻（chlorella sorokiniana）已于2023年4月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：中国北京。

7、在另一方面，本发明还提供了索罗金小球藻金黄色突变株fzu60-mt03在联产蛋白质和叶黄素中的应用。

8、本发明还提供了一种异养培养所述的索罗金小球藻金黄色突变株的方法，其特征在于：包括如下步骤：

9、一级培养：挑选fzu60-mt03单克隆，在modifiedmannandmyer’s液体培养基中活化2天；

10、二级培养：待细胞进入对数生长期时，加入新鲜的modifiedmannandmyer’s液体培养基使藻液稀释5倍，在25-35℃的摇床中培养至第3天；

11、三级培养：将二级培养液接种至种子罐中，控制温度为25-35℃、ph值为7.0-8.0、通气量为1-2vvm，溶氧与转速关联控制在10-30％，随发酵进行不断提高关联转速的下限值；发酵罐中培养基为modifiedmannandmyer’s液体培养基，每当碳源耗尽时(即溶氧突然上升时)流加1倍量的培养基浓缩液，培养4天；

12、发酵培养：将三级培养液接种至发酵罐中，控制温度为25-35℃、ph值为7.0-8.0、通气量为1-2vvm，溶氧与转速关联控制在10-30％，随发酵进行不断提高关联转速的下限值；发酵罐中培养基为modifiedmannandmyer’s液体培养基，培养过程流加氮源浓缩液控制氮浓度在12-24mm，同时每当碳源耗尽时(即溶氧突然上升时)流加1倍量的不含氮源的培养基浓缩液，培养天数7-9天；

13、其中，所述的modifiedmannandmyer’s液体培养基的优选组成是：葡萄糖10g/l，尿素0.6183g/l，七水硫酸镁0.4g/l，二水氯化钙0.15g/l，三水磷酸氢二钾0.1g/l，edta·2na75mg/l，硼酸15mg/l，七水硫酸亚铁5mg/l，四水氯化锰3.5mg/l，七水硫酸锌0.825mg/l，六水硝酸钴0.0175mg/l，五水硫酸铜0.005mg/l；

14、所述的培养基浓缩液其浓缩倍数为75倍。

15、本发明的显著优点在于：

16、本发明提供藻株为高蛋白质、高叶黄素含量且叶绿素合成缺陷型的突变株，藻细胞呈现金黄色，同时采用本发明所提出的异养发酵工艺，不仅可实现微藻高密度异养培养，而且还可让藻细胞同步积累高含量的蛋白质和叶黄素，所达到的生产效率远高于国内外报道结果。采用本发明突变株不仅可简化后期叶黄素和蛋白质的提取制备工艺，还可改善藻粉的感官接受度，能够显著提高利用微藻联合生产叶黄素和营养蛋白的工业化前景。

技术特征：

1.一株索罗金小球藻金黄色突变株fzu60-mt03，其特征在于：其分类命名为淡水小球藻（chlorella sorokiniana），已于2023年4月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.40457，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.如权利要求1所述的索罗金小球藻金黄色突变株fzu60-mt03在异养发酵联产蛋白质和叶黄素中的应用。

3.一种联产蛋白质和叶黄素的方法，其特征在于：采用如权利要求1所述的索罗金小球藻金黄色突变株fzu60-mt03异养发酵联产蛋白质和叶黄素。

技术总结
本发明提供一株索罗金小球藻金黄色突变株FZU60‑MT03及其应用。索罗金小球藻金黄色突变株FZU60‑MT03的分类命名为淡水小球藻（Chlorella sorokiniana），其已于2023年4月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.40457，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。与原始株FZU60相比，由于突变株FZU60‑MT03在异养条件下不合成叶绿素，且细胞内可积累更高的叶黄素和蛋白质含量，使其细胞呈现金黄色。本发明突变株FZU60‑MT03可通过异养发酵高效联产蛋白质和叶黄素，不仅可简化后期叶黄素和蛋白质的提取制备工艺，还可改善藻粉的感官接受度，为微藻叶黄素和微藻蛋白质的产业化生产及应用提供优质种质资源。

技术研发人员：谢友坪,马瑞娟,陈剑锋
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15