一种猪外周血单核细胞的制备方法与流程

本发明涉及细胞制备，具体涉及一种猪外周血单核细胞的制备方法。

背景技术：

1、外周血(peripheral blood)是机体内具有造血、免疫和防御机能，柔软且富有血液的组织，是除骨骼之外的血液的总称。猪外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，pbmc)为外周血中不同内各种细胞的总称，外周血中的细胞类型众多，主要含有红细胞、白细胞和血小板，单核细胞是血液中最大的血细胞，也是体积最大的白细胞。猪外周血单核细胞(pbmc)主要包括淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞，是机体免疫系统的重要组成部分，具有抗御病原体入侵、吞噬异物并产生抗体和机体损伤后治愈等功能，机体的生理或病理变化通常会造成血液中免疫细胞数量和成分的变化。猪外周血中t淋巴细胞丰富，但淋巴细胞亚群的功能和作用尚不清楚。nk细胞在防御病毒、寄生虫和细菌等病原体感染中发挥重要作用。b细胞则主要负责产生抗体，帮助身体抵御病原体的入侵。总之，外周血与身体的每个器官和组织相互作用，因此其状态和数量可以反映机体生理和病理状态，这种与身体状态的反射关系，使得外周血成为疾病预测，诊断的重要组织类型。

2、猪pbmc的制备研究因非洲猪瘟(african swine fever，asf)病大流行而有所增多。非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)引起的烈性传染病，在软蜱，家猪，野猪之间传播，oie将其列为法定报告动物疾病。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率接近100％，目前，无有效疫苗，无特效药物，对全世界养殖业造成了巨大的经济损失。我国也将其被列为一类动物疫病。asfv是一种双链dna病毒，具有二十面体的形态。asfv复杂庞大的病毒基因组及其调节宿主免疫反应的能力还需要进一步研究。非洲猪瘟病毒自发现100多年来，采用传统疫苗研制策略均未成功。目前，通过基因缺失致弱成为该疫苗研究重要的方向，但非洲猪瘟病毒只能通过极少数的原代细胞培养后配制成的疫苗才有效，其中，猪pbmc分化成的巨噬细胞就是其中一种最重要的原代细胞。有研究表明巨噬细胞是猪感染asfv的主要靶点。因此对猪pbmc的获取和分析具有重要的临床意义。

3、猪pbmc的常规制备方法多采用ficoll试剂进行密度梯度离心法，适用于制备少量猪pbmc，多用于实验室研究，但是常规制备方法主要存在制备量不稳定，制备量少，操作时间过长，污染难控，成本高等问题，一直无法制备大量的目的细胞用于放大生产研究。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提出一种猪外周血单核细胞的制备方法，旨在解决现有猪外周血细胞制备时细胞污染率高、细胞制备量少、制备效率低的问题。

2、为实现上述目的，本发明提出一种猪外周血单核细胞的制备方法，包括以下步骤：

3、获得标准猪源样品；

4、获得全血采血装置；

5、利用所述全血采血装置从所述猪源样品上采集抗凝血样品，静置分层后吸取上层细胞样品，离心去上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物；

6、将所述猪外周血单核细胞沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的猪外周血单核细胞沉淀物；

7、将所述不含红细胞的猪外周血单核细胞沉淀物重悬、离心、洗涤，再进行细胞培养，获得猪外周血单核细胞。

8、可选地，在所述获得全血采血装置的步骤中，所述全血采血装置包括：

9、混匀装置，包括第一容器和三通结构，所述三通结构包括第一支路、第二支路和第三支路，所述第一支路连接至所述第一容器；

10、全血输出装置，包括输血管，一端连接至所述猪源样品，另外一端连接至所述第二支路，用于将所述猪源样品中的猪全血样品输送至所述第二支路；以及，

11、冷凝装置，包括第二容器和输液管，所述第二容器内设有抗凝液，所述输液管的一端连接至所述抗凝液，另外一端连接至所述第三支路，用于将所述抗凝液输送至所述第三支路。

12、可选地，所述全血输出装置还包括控制器和固定器，所述控制器和所述固定器间隔设于所述输血管上，且所述控制器设于靠近所述第二支路的一侧；和/或，

13、所述输血管远离所述第二支路的一端呈倾斜设置。

14、可选地，所述冷凝装置还包括：

15、第三容器，所述第三容器内形成有容纳腔，所述容纳腔内设有冷凝液；

16、温度计，设于所述第三容器内，用于检测所述冷凝液的温度；以及，

17、泵，设于所述输液管上；

18、其中，所述第二容器设于所述第三容器内，且被所述容置腔内的冷凝液环绕设置。

19、可选地，所述第一支路、所述第二支路和所述第三支路的交界处设有混匀叶片，所述混匀叶片用于搅拌混匀所述抗凝液和所述猪全血样品。

20、可选地，所述抗凝液的组分包含：3％的明胶、100～200u/ml的青霉素、0.1～0.2mg/ml链霉素和无菌0.01mol/l的pbs。

21、可选地，所述利用所述全血采血装置从所述猪源样品上采集抗凝血样品，静置分层后吸取上层细胞样品，离心去上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物的步骤还包括以下步骤：

22、将所述标准猪源样品麻醉，利用所述全血采血装置收集所述标准猪源样品的抗凝血；

23、将所述凝抗血至于无菌环境静置20～60min，分层后吸取上层细胞样品；

24、将所述上层细胞样品在1000～1500rpm的转速下，离心处理8～12min，去除上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物。

25、可选地，所述红细胞裂解液包括1.2～1.5mol/l nh4cl、90～110mmol/lkhco3和8～15mmol/l na4edta；和/或，

26、所述红细胞裂解液的ph值为7.2～7.4。

27、可选地，所述细胞培养的培养基配方包括78～89％rpmi 1640、10～20％fbs和1～2％双抗。

28、可选地，所述获得标准猪源样品的步骤还包括以下步骤：

29、采集1～2ml的猪源样品的血清，分离血清，获得猪血清；

30、对所述猪血清分别进行猪圆环病毒ii型、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测，筛选获得标准猪源样品。

31、本发明的技术方案中，本发明所提供的制备方法操作简单，制备过程中细胞污染率较低，细胞制备；量稳定，且细胞制备量高，操作时间短，制备效率高；在制备过程中，采用全血采血装置直接从标准猪源样品获得采集抗凝血样品，一方面能够尽可能多的收集血样，从而获得更多的猪外周血单核细胞，另外一方面，直接通过全血采血装置获得抗凝血样品可以降低污染；用红细胞裂解液裂解收集的细胞悬液，裂解效果更加好，培养后的细胞状态更加优，存活率更加高。

技术特征：

1.一种猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，在所述获得全血采血装置的步骤中，所述全血采血装置包括：

3.如权利要求2所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述全血输出装置还包括控制器和固定器，所述控制器和所述固定器间隔设于所述输血管上，且所述控制器设于靠近所述第二支路的一侧；和/或，

4.如权利要求2所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述冷凝装置还包括：

5.如权利要求2所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述第一支路、所述第二支路和所述第三支路的交界处设有混匀叶片，所述混匀叶片用于搅拌混匀所述抗凝液和所述猪全血样品。

6.如权利要求2所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述抗凝液的组分包含：3％的明胶、100～200u/ml的青霉素、0.1～0.2mg/ml链霉素和无菌0.01mol/l的pbs。

7.如权利要求1所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述利用所述全血采血装置从所述猪源样品上采集抗凝血样品，静置分层后吸取上层细胞样品，离心去上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物的步骤还包括以下步骤：

8.如权利要求1所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述红细胞裂解液包括1.2～1.5mol/l nh4cl、90～110mmol/l khco3和8～15mmol/l na4edta；和/或，

9.如权利要求1所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞培养的培养基配方包括78～89％rpmi 1640、10～20％fbs和1～2％双抗。

10.如权利要求1所述的猪外周血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述获得标准猪源样品的步骤还包括以下步骤：

技术总结
本发明公开一种猪外周血单核细胞的制备方法，包括以下步骤：获得标准猪源样品；获得全血采血装置；利用所述全血采血装置从所述猪源样品上采集抗凝血样品，静置分层后吸取上层细胞样品，离心去上层清液，获得猪外周血单核细胞沉淀物；将所述猪外周血单核细胞沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的猪外周血单核细胞沉淀物；将所述不含红细胞的猪外周血单核细胞沉淀物重悬、离心、洗涤，再进行细胞培养，获得猪外周血单核细胞。本发明旨在提供一种制备方法，以制备出低污染、质量好，制备量高的猪外周血单核细胞。

技术研发人员：秦涛,张飞雁,侯林静,邓永欢,周平,韩燕,何珊,秦伟,胡杨,秦红刚,郑江涛,谢红玲
受保护的技术使用者：国药集团动物保健股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15