红鳍东方鲀精原干细胞系及其建立、鉴定和冻存方法与流程

本发明属于细胞生物学，具体是一种红鳍东方鲀精原干细胞系及其建立、鉴定和冻存方法。

背景技术：

1、红鳍东方鲀俗称河豚，属于硬骨鱼纲、鲀形目、鲀科、东方鲀属，因其肉质鲜美和营养价值高而广受欢迎。但是，由于野生红鳍东方鲀的捕获量逐年下降。相比之下，水产养殖产量自20世纪90年代以来一直在增加，最近已达到野生鱼类捕鱼量的17倍。由于红鳍东方鲀具有较高的经济价值，逐渐成为我国的主要水产养殖物种。尽管河豚对水产养殖业具有重要意义，但直到最近，在红鳍东方鲀选育方面的研究进展甚微。因此，生产具有理想遗传性状的红鳍东方鲀种群，如高生长性能或抗病性，是迫在眉睫的。红鳍东方鲀生长缓慢，需要17-18个月才能达到1公斤。河豚选育存在两大障碍。首先，雄性和雌性分别有2年和3年的繁殖时间才能成熟。其次，亲代红鳍东方鲀的体型(2-5公斤)比市场平均体型(0.6-1.0公斤)大得多。

2、精原干细胞自我更新和分化之间的适当平衡对于确保精子发生的持续稳态至关重要。除此以外，精原干细胞是一种独特的干细胞，它具有细胞干性，具有分化成细胞组织的能力。

3、利用现有精原干细胞的培养方法用于红鳍东方鲀的精原干细胞的体外培养，培养的精原干细胞纯度不高。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于提供红鳍东方鲀精原干细胞系及其建立、鉴定和冻存方法。本发明方法可以获得更高纯度且能长期传代的红鳍东方鲀精原干细胞。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

3、一种红鳍东方鲀精原干细胞的建立方法，包括以下步骤：

4、步骤1：将6月龄红鳍东方鲀精巢组织块使用含有8％青霉素-链霉素-两性霉素b的l-15培养基清洗干净，组织块移入胰蛋白酶中消化；

5、步骤2：将完全培养基中加入消化后的组织块中，移入到培养瓶中，在23℃的无菌培养箱中培养；

6、步骤3：在初始培养的前15天，每隔三天利用完全培养基换培养液，换培养液量为原体积的一半，在15天之后，每3-4天换一次培养液，完全换培养液；

7、步骤4：在培养的第20天时观察培养细胞状态，将纤维状的细胞刮出弃掉；

8、步骤5：在培养第30天，细胞增长满培养瓶，利用胰蛋白酶消化细胞成细胞悬液传代；

9、步骤6：在原代细胞生长到培养瓶底部面积的90％时，吸弃旧的培养基，然后用含有体积比8％青霉素-链霉素-两性霉素b的l-15轻轻清洗细胞，加入胰蛋白酶待精原干细胞变圆后，加入等量的细胞生长培养基轻摇细胞培养瓶将首先脱落的细胞转到新的培养瓶中孵育，将培养瓶转移到培养箱中静置，然后将细胞悬液转移到新的培养瓶中，再将培养瓶转移到23℃和含5％co2培养箱中按照如此细纯化方法重复至第10代；

10、步骤7：将第10代的精原干细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液，并用完全培养基调整细胞浓度到1000-5000个/ml；将调整浓度的细胞按照每孔100μl的体积转移到96孔板中培养，在4-6h后显微镜下观察并标记孔中是单细胞的孔，连续观察并剔除没有成活细胞的孔；当细胞的融合度达到每孔的60-80％的时候将细胞消化下来，转移到24孔板中扩大培养，细胞的融合度到每孔75-85％时转移到12孔板中，细胞的融合度到每孔75-85％时转移到6孔板中，细胞的融合度到每孔75-85％时转移到t25培养瓶中正常培养。

11、进一步地，步骤1中红鳍东方鲀的体重120±20g，体长为13±2cm。

12、进一步地，步骤1中的胰蛋白酶的浓度为0.05％。

13、进一步，所述的细胞生长培养基的成分及终浓度：体积比10-15％fbs、体积比1％牙鲆血清、体积比1％牙鲆出膜卵胚胎提取物、2ng/ml重组人白血病抑制因子、2ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、5mol/lhepes缓冲液、β-巯基乙醇50μmol/l。

14、本发明还提供所述方法建立的红鳍东方鲀精原干细胞系。

15、本发明还提供红鳍东方鲀精原干细胞系的冻存方法，所述方法为将红鳍东方鲀精原干细胞长至80-90％的融合度时进行冻存的处理，首先将细胞利用0.25％胰酶消化后加入同等体积含有胎牛血清的完全培养基终止消化，将细胞1500rpm，离心5min获得细胞沉淀，加入2ml细胞冻存液重悬细胞保存到细胞冻存管，所述细胞冻存液各成分的体积比：10％dmso、20％fbs与70％l-15；将细胞冻存管转移到程序降温盒在-80℃冰箱暂时保存24h，最后将细胞系放入液氮中长久保存。

16、本发明还提供红鳍东方鲀精原干细胞系的复苏方法，所述方法为将在液氮中保存的细胞转移到37℃水浴锅中快速溶解，然后室温下1500rpm离心5min，获得细胞沉淀，用完全培养基重悬细胞后接种到细胞培养瓶在23℃培养箱继续培养。

17、本发明还提供红鳍东方鲀精原干细胞系的鉴定方法，所述方法将第30代的红鳍东方鲀精原干细胞在含有10μm维生素a酸的培养液中悬浮培养培养7天；之后将细胞分离出来，接种到6孔板中孵育12h后在显微镜下观察细胞并拍照；

18、红鳍东方鲀精原干细胞在维生素a酸连续处理一周后，最终分化成其他类型的体细胞，表明红鳍东方鲀精原干细胞具在体外具有多能性。

19、本发明与现有技术相比的有益效果：现有的培养条件未建立红鳍东方鲀长期体外培养精原干细胞的方法。本发明根据红鳍东方鲀精原干细胞的特性，获得纯度较高的红鳍东方鲀精原干细胞，再利用单细胞克隆技术分离、培养红鳍东方鲀精原干细胞。本发明在获得红鳍东方鲀精原干细胞的基础上，通过不同的培养的条件摸索和优化，建立了适合精原干细胞稳定传代的培养液体系和培养条件，并开展了基因转染和体外诱导的研究，为红鳍东方鲀精原干细胞的广泛研究提供了技术支撑；本研究还提供了全面且系统的红鳍东方鲀精原干细胞的鉴定方法。本发明方法能够成功建立红鳍东方鲀精原干细胞系并能够持续传代超过60代。

技术特征：

1.一种红鳍东方鲀精原干细胞的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种红鳍东方鲀精原干细胞的建立方法，其特征在于，所述步骤1中红鳍东方鲀的体重120±20g，体长为13±2cm。

3.根据权利要求1所述的一种红鳍东方鲀精原干细胞的建立方法，其特征在于，所述步骤1中的胰蛋白酶的浓度为0.05％。

4.根据权利要求1所述的一种红鳍东方鲀精原干细胞的建立方法，其特征在于，所述的细胞生长培养基的成分及终浓度：体积比10-15％fbs、体积比1％牙鲆血清、体积比1％牙鲆出膜卵的胚胎提取物、2ng/ml重组人白血病抑制因子、2ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、5mol/lhepes缓冲液、β-巯基乙醇50μmol/l。

5.一种红鳍东方鲀精原干细胞系，其特征在于，所述细胞系是根据权利要求1-4任何一项所述方法建立。

6.权利要求5所述红鳍东方鲀精原干细胞系的冻存方法，其特征在于，所述方法为将红鳍东方鲀精原干细胞长至80-90％的融合度时进行冻存的处理，首先将细胞利用0.25％胰酶消化后加入同等体积含有胎牛血清的完全培养基终止消化，将红鳍东方鲀精原干细胞于1500rpm，离心5min获得细胞沉淀，加入细胞冻存液重悬细胞并保存到细胞冻存管，所述细胞冻存液中各成分的体积比：10％dmso、20％fbs与70％l-15；将细胞冻存管转移到程序降温盒在-80℃冰箱暂时保存24h，最后将每代的细胞放入液氮中长久保存。

7.权利要求6所述冻存方法冻存的红鳍东方鲀精原干细胞系的复苏方法，其特征在于，将在液氮中保存的细胞转移到37℃水浴锅中快速溶解，然后在室温下1500rpm离心5min，获得细胞沉淀，用完全培养基重悬细胞后接种到细胞培养瓶在23℃培养箱继续培养。

8.权利要求5所述红鳍东方鲀精原干细胞系的鉴定方法，所述方法将第30代的红鳍东方鲀精原干细胞在含有10μm维生素a酸的培养液中悬浮培养培养7天；之后将细胞分离出来，接种到6孔板中过夜培养后在显微镜下观察；红鳍东方鲀精原干细胞在维生素a酸处理一周后，最终分化成其他类型的体细胞，表明红鳍东方鲀精原干细胞具在体外具有多能性。

技术总结
本发明涉及一种红鳍东方鲀精原干细胞系及其建立、鉴定和冻存方法，属于细胞生物学技术领域，本发明根据红鳍东方鲀精原干细胞的特性，获得纯度较高的红鳍东方鲀精原干细胞，再利用单细胞克隆技术分离、培养红鳍东方鲀精原干细胞。本发明建立了适合精原干细胞稳定传代的培养液体系和培养条件，并同时建立了红鳍东方鲀精原干细胞系的冻存和复苏方法。所构建的红鳍东方鲀精原干细胞系能够用于基因转染和体外诱导的研究，本发明还提供了全面且系统的红鳍东方鲀精原干细胞的鉴定方法。本发明方法能够成功建立红鳍东方鲀精原干细胞系并能够持续传代超过60代。

技术研发人员：邵长伟,谭磊磊,王倩,王洪岩,刘凯强,刘宇岩
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院黄海水产研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15