一种1,3-丙二醇脱氢酶突变体及产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌

本发明涉及一种1,3-丙二醇脱氢酶突变体及产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌，属于生物。

背景技术：

1、1,3-丙二醇(简称1,3-pdo)是一种重要的精细化工原料和医药中间体，主要用作聚酯和聚氨酯的合成单体。此外，在其它方面还有很多用途，比如可以用作溶剂、抗冻剂、保护剂等，或者用于合成医药等。

2、1,3-pdo的生产方法主要分为化学合成法和生物合成法。化学合成法主要包括了环氧乙烷羰基化法和丙烯醛水解法等，但随着科技水平的进步，化学合成法中高昂的原料价格及复杂的反应工艺条件已经逐步被生物合成法所替代。

3、生物合成法生产1,3-pdo是利用微生物歧化甘油产生。自然界中可将甘油转化为1,3-pdo的微生物主要是厌氧或兼性厌氧菌，其中克雷伯氏肺炎杆菌(klebsiellapneumoniae)、丁酸梭状芽胞杆菌(clostridium butyricum)及弗氏柠檬酸菌(citrobacterfreundii)具有较高的1,3-pdo转化率，而且对甘油和产物1,3-pdo具有较高的耐受力，因此具有较高的开发价值与应用前景。目前，调控1,3-pdo合成的关键酶及其基因得到了广泛的研究。在1,3-pdo的代谢路径上，3-羟基丙醛(3-hpa)是一种重要的代谢中间产物，其来源于甘油的酶促脱水，随后在醛基还原酶催化下还原为1,3-pdo。但如唐浩等对克雷伯氏肺炎杆菌发酵生产1,3-丙二醇条件和补料策略进行了研究，发现采用甘油/碱耦合流加的新补料策略，1,3-丙二醇质量转化率、摩尔转化率和生产强度分别达到了0.5g/g，0.6mol/mol和2.2g/(l·h),1,3-丙二醇的产量达到了53.5g/l；陈珍等筛选得到一株高产1,3-pdo的克雷伯氏肺炎杆菌hr526，在5l发酵罐中进行甘油补料流加发酵，产量达到91.47g/l，目前微生物合成1,3-pdo的效果仍需进一步提升。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种高效、高产，可利用甘油为底物，发酵改造后的克雷伯氏菌高产1,3-丙二醇，该菌株发酵过程中操作便捷，产量更高。

2、本发明的第一个目的是提供一种1,3-丙二醇脱氢酶突变体，通过将氨基酸序列如seq id no.8所示的1,3-丙二醇脱氢酶的第186位甘氨酸突变为天冬氨酸，并将第281位组氨酸突变为天冬酰胺得到(g186d/h281n)。

3、本发明的第二个目的是提供编码上述1,3-丙二醇脱氢酶突变体的基因。

4、本发明的第三个目的是提供携带上述基因的重组质粒。

5、本发明的第四个目的是提供表达上述1,3-丙二醇脱氢酶突变体的宿主细胞。

6、进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。

7、本发明的第五个目的是提供上述1,3-丙二醇脱氢酶突变体、基因、重组质粒或宿主细胞在制备1,3-丙二醇或含1,3-丙二醇的产品中的应用。

8、本发明的第六个目的是提供一种生产1,3-丙二醇的重组克雷伯氏肺炎杆菌，所述重组克雷伯氏肺炎杆菌异源表达了醛基还原酶编码基因yqhd，过表达了甘油脱水酶编码基因dhab、苹果酸酶编码基因maeb和上述1,3-丙二醇脱氢酶突变体编码基因，并敲除了α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因buda、d-乳酸脱氢酶ldh编码基因ldha、乙醛脱氢酶aldh编码基因alda和pts转运系统关键酶编码基因crr。

9、进一步地，所述α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因buda的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述d-乳酸脱氢酶ldh编码基因ldha的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述乙醛脱氢酶aldh编码基因alda的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述pts转运系统关键酶编码基因crr的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述甘油脱水酶编码基因dhab的核苷酸序列如seqid no.5所示，所述苹果酸酶编码基因基因maeb的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述醛基还原酶编码基因yqhd的核苷酸序列如seq id no.7所示。

10、进一步地，所述醛基还原酶编码基因yqhd、甘油脱水酶编码基因dhab、苹果酸酶编码基因maeb和1,3-丙二醇脱氢酶突变体编码基因由pk启动子调控表达。

11、进一步地，所述pk启动子的核苷酸序列如seq id no.9所示。

12、进一步地，以klebsiella pneumoniae atcc 13883为出发菌株。

13、本发明的第七个目的是提供一种生产1,3-丙二醇的方法，包括采用上述重组克雷伯氏肺炎杆菌进行发酵生产的步骤。

14、进一步地，以甘油为底物进行发酵生产。

15、进一步地，所述发酵为，将菌种接入含甘油的种子培养基中进行好氧培养，得到种子液，将种子液接入含甘油的发酵培养基中，在温度30-37℃、ph6.0-8.0、通气量0.1-1vvm空气下进行发酵，发酵过程中流加甘油至发酵36-48h时停止流加。

16、进一步地，流加甘油使发酵体系中的甘油浓度控制在10-50g/l。

17、进一步地，在种子培养基中培养时的条件为温度30-37℃、转速80-120rpm下好氧培养6-10h。

18、进一步地，种子培养基或发酵培养基中的初始甘油浓度均为20-25g/l。

19、进一步地，在发酵过程中加入维生素c和维生素e。

20、进一步地，在初始发酵培养基中加入140-160mg/l的维生素c和维生素e混合营养液。

21、进一步地，加10-50ml维生素c和维生素e混合营养液。

22、进一步地，种子培养基的组分包括：0.5-1g/l硫酸铵，2.5-5g/l三水磷酸氢二钾，1-2g/l磷酸二氢钾，0.1-0.5g/l七水硫酸镁，0.5-2.5g/l酵母粉，0.5-2ml/l微量元素溶液。

23、进一步地，发酵培养基的组分包括：1-3g/l硫酸铵，0.5-1.5g/l三水磷酸氢二钾，0.3-1g/l磷酸二氢钾，0.1-0.5g/l七水硫酸镁，1-2g/l酵母粉，1-5ml/l微量元素溶液。

24、本发明的有益效果：

25、本发明通过在克雷伯氏菌中敲除了编码α-乙酰乳酸脱羧酶的buda基因，敲除了编码d-乳酸脱氢酶ldh的ldha基因，敲除了编码乙醛脱氢酶aldh的alda基因，敲除了pts转运系统关键酶编码基因crr，过表达了本源甘油脱水酶基因dhab、本源苹果酸酶基因maeb和来自大肠杆菌的醛基还原酶基因yqhd，并突变了本源编码1,3-丙二醇脱氢酶dhat基因，成功构建一株高产1,3-丙二醇的基因工程菌。该工程菌能够利用甘油为底物，5l发酵罐中产物产量达到125g/l，相比导入野生型dhat基因工程菌的产量提高了27.6％。经过发酵优化后，产量达到130g/l，生产强度、最大细胞干重以及转化率都有明显提升。

技术特征：

1.一种1,3-丙二醇脱氢酶突变体，其特征在于：通过将氨基酸序列如seq id no.8所示的1,3-丙二醇脱氢酶的第186位甘氨酸突变为天冬氨酸，并将第281位组氨酸突变为天冬酰胺得到。

2.编码权利要求1所述1,3-丙二醇脱氢酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。

4.表达权利要求1所述1,3-丙二醇脱氢酶突变体的宿主细胞。

5.权利要求1所述1,3-丙二醇脱氢酶突变体、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组质粒或权利要求4所述宿主细胞在制备1,3-丙二醇或含1,3-丙二醇的产品中的应用。

6.一种生产1,3-丙二醇的重组克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述重组克雷伯氏肺炎杆菌异源表达了醛基还原酶编码基因yqhd，过表达了甘油脱水酶编码基因dhab、苹果酸酶编码基因maeb和上述1,3-丙二醇脱氢酶突变体编码基因，并敲除了α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因buda、d-乳酸脱氢酶ldh编码基因ldha、乙醛脱氢酶aldh编码基因alda和pts转运系统关键酶编码基因crr。

7.根据权利要求6所述的重组克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述醛基还原酶编码基因yqhd、甘油脱水酶编码基因dhab、苹果酸酶编码基因maeb和1,3-丙二醇脱氢酶突变体编码基因由pk启动子调控表达。

8.根据权利要求7所述的重组克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述pk启动子的核苷酸序列如seq id no.9所示。

9.根据权利要求6所述的重组克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：以klebsiellapneumoniae atcc 13883为出发菌株。

10.一种生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于：包括采用权利要求6-9任一项所述重组克雷伯氏肺炎杆菌进行发酵生产的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：以甘油为底物进行发酵生产。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述发酵为，将菌种接入含甘油的种子培养基中进行好氧培养，得到种子液，将种子液接入含甘油的发酵培养基中，在温度30-37℃、ph6.0-8.0、通气量0.1-1vvm空气下进行发酵，发酵过程中流加甘油至发酵36-48h时停止流加。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：流加甘油使发酵体系中的甘油浓度控制在10-50g/l。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：在种子培养基中培养时的条件为温度30-37℃、转速80-120rpm下好氧培养6-10h。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：种子培养基或发酵培养基中的初始甘油浓度均为20-25g/l。

16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：在发酵过程中加入维生素c和维生素e。

技术总结
本发明公开了一种1,3‑丙二醇脱氢酶突变体及产1,3‑丙二醇的克雷伯氏菌，属于生物技术领域。本发明以Klebsiella pneumoniae ATCC 13883为出发菌株，通过敲除编码α‑乙酰乳酸脱羧酶的budA基因，编码d‑乳酸脱氢酶LDH的ldhA基因，编码乙醛脱氢酶ALDH的aldA基因，PTS转运系统关键酶编码基因crr，过表达甘油脱水酶基因dhaB和苹果酸酶基因maeB、来自大肠杆菌的醛基还原酶基因yqhD和突变后的1,3‑丙二醇脱氢酶dhaT，获得了重组克雷伯氏菌KP‑FMME；利用此重组菌株进行5L发酵罐发酵，经发酵条件优化，重组克雷伯氏菌KP‑FMME以甘油为原料发酵48h，可生产130g/L的1,3‑丙二醇，具有十分广阔的应用前景。

技术研发人员：刘立明,张少伦,高聪,刘佳,陈修来,吴静,宋伟,魏婉清
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15