一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞、方法及其用途与流程

本发明属于细胞，具体涉及到一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞、方法及用途。

背景技术：

1、ips 细胞首先于 2006 年从小鼠细胞中产生 (takahashi 等人，2006) 以及于2007 年从人细胞中产生 (takahashi 等人，2007 ；yu 等人，2007)。这被认为是在干细胞研究中的 重要进展，因为它可使研究人员能够获得在研究中具有重要意义并且潜在地具有治疗应用 的多潜能干细胞，而不必争议性地使用胚胎。

2、在人中，ipsc通常是从真皮成纤维细胞产生。然而，对于皮肤活组织检查的需 求和在体外扩展成纤维细胞数个传代的需要使其成为用于产生患者特异性干细胞的麻烦的来源。而且，先前的用于重编程人体细胞的方法是不方便的，因为它们需要从人受试者直接获取体细胞，或将细胞维持于费力的细胞培养系统中。

3、目前，国际上已经开发出多种ipsc重编程方法，但各种方法均存在一定的局限性。如利用仙台病毒或者慢病毒携带不同的外源性转录因子在细胞中表达从而启动细胞重编程，该类方法的缺点在于基因组的随机插入可能会带来潜在风险，而且病毒诱导实验成本较高。利用脂质体包裹携带外源性转录因子重编程法，即在载体两侧插入了loxp位点，在完成诱导后通过瞬时表达cre重组酶而删除此重编程构件，该系统在重编程完成后可对外源基因进行删除，可以避免重编程因子的激活，从而降低了肿瘤生成的风险，但是此系统的重编程因子去除效率极低，并且删除重编程构件后，细胞内仍残留含loxp位点的载体。

4、现有技术中重编程获得ipsc的时间大约在30天左右，周期较长。并且现有技术中需要进行抽取血液，正常若是抽8ml血提取2×107-8×107的pbmc，血液是人或高等动物体内循环系统中的液体组织，由血浆、血细胞构成，对维持生命起重要作用。若想到获取更多的ipsc便是需要抽取更多的血，本方案通过研究实现抽较少的血即可进行重编程获得高效率的ipsc。

5、目前现有的诱导人体细胞为ips细胞的技术体系普遍面临着效率低、诱导时间长，制备成本高等问题。为使人ips细胞在再生医学和疾病发生机制研究中得到广泛应用，必须探索一种高效的诱导策略，即能够缩短ips细胞诱导时间以及提高重编程效率的重编程方法。

技术实现思路

1、本申请为了提供一种低成本高重编程效率的重编程方法获得的诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞（ipsc）通过如下步骤获得：

2、ⅰ、所述诱导多能干细胞（ipsc）是通过外周血单个核细胞（pbmc）直接重编程获取；

3、ⅱ、所述ipsc是通过电转方式获得，得到重编程效率较高的ips细胞株。

4、进一步改进在于，所述pbmc的数量与电转液的体积用量的减少能够获取重编程效率较高的ips细胞株。

5、进一步改进在于，所述重编程的效率能够达到0.25%。

6、进一步改进在于，所述pbmc的初始细胞量在5×104-1×106cells。

7、进一步改进在于，所述电转液的体积用量在5-100ul。

8、进一步改进在于，所述pbmc通过如下方法获得：将pbmc培养0 -5天，计数，低速离心，并用dpbs洗一次，弃上清，通过培养基i对pbmc进行培养，所述培养基i包含基础培养基和添加剂；

9、所述基础培养基包括stempro34、x-vivo15、imdm、stemspan-xf、stemspan-h3000中的任一种或者多种的组合；

10、所述添加剂包括浓度体积浓度为1-100 ng/ml scf、 1-100 ng/ml flt3l、1-100ng/ml il3、1-100 ng/ml il6、100-150ug/ml transferrin、0.1-5% hsa、glutamax(1x)中任意一种或者多种的组合。

11、进一步改进在于，pbmc培养天数为1-4天。

12、进一步改进在于，所述ipsc通过电转获得，在电转后第一天，每孔补充0.5-5ml培养基ii，培养基ii包括e8、 体积百分比为0.1%-5%人血清白蛋白、0-10um chir99021、0-10um pd0325901、0-10um a83-01中的中任意两种以上的组合。

13、进一步改进在于，电转后第二天起，全换液，补1-5ml所述培养基ii，继续每天换液，至ipsc克隆出现。

14、进一步改进在于，所述重编程系统包含一个或多个载体，所述一个或多个载体是质粒。

15、进一步改进在于，所述质粒通过电转导入pbmc细胞，培养通过电转导入质粒后的pbmc细胞直至获得ipsc克隆；

16、所述质粒包括pcep4-m2l、pep4 e02s em2k、pep4 e02s en2k、pep4 e02s et2k任意三种或三种以上的组合。

17、进一步改进在于，上述质粒pcep4-m2l、pep4 e02s em2k、pep4 e02s en2k、pep4e02s et2k的用量均设置在0.1-1.5 ug。

18、本方案还公开一种将外周血单个核细胞（pbmc）重编程为诱导性多能干细胞的方法，包括上述重编程系统方式获取。

19、本方案还包含通过所述的重编程系统的试剂盒。

20、本方案还公开上述的重编程系统方式或上述的试剂盒用于诱导外周血单个核细胞（pbmc）重编程为人诱导性多能干细胞的用途。

21、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

22、其一.通过电转化的方式对pbmc细胞直接进行重编程操作，进而获得ipsc克隆，整个重编程周期在15天左右，缩短了重编程周期，提高效率。

23、其二.本发明提供摸索得到意料之外的效果是当电转液的用量减少时，重编程的效率提高，重编程效率能够达到0.25%，并且获取的ipsc细胞的纯度较高。

24、其三.用较少的pbmc细胞量即抽取少量的血即可获得更高的ipsc细胞株，减少获取成本。

技术特征：

1.一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，电转液体积用量的减少能够获取重编程效率较高的ips细胞株。

3.如权利要求2所述的一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，所述电转液的体积用量在5-100ul。

4.如权利要求2所述的一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，所述pbmc通过如下方法获得：将pbmc培养0 -5天，计数，低速离心，并用dpbs洗一次，弃上清，通过培养基i对pbmc进行培养，所述培养基i包含基础培养基和添加剂；

5.如权利要求4所述的一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，pbmc培养天数为1-4天。

6.如权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，所述ipsc通过电转获得，在电转后第一天，每孔补充0.5-5ml培养基ii，培养基ii包括e8、 0.1%-5%人血清白蛋白、0-10um chir99021、0-10um pd0325901、0-10um a83-01中的中任意两种以上的组合。

7.如权利要求6所述的一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，电转后第二天起，全换液，补1-5ml所述培养基ii，继续每天换液，至ipsc克隆出现。

8.如权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，所述重编程的效率能够达到0.25%。

9.如权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，所述pbmc的初始细胞量在5×104-1×106cells。

10.如权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，所述重编程系统包含一个或多个载体，所述一个或多个载体是质粒；所述质粒通过电转导入pbmc细胞，培养通过电转导入质粒后的pbmc细胞直至出现ipsc克隆； 所述质粒包括pcep4-m2l、pep4 e02s em2k、pep4 e02s en2k、pep4 e02s et2k任意三种或三种以上的组合。

11.如权利要求10所述的一种从外周血单个核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，其特征在于，上述质粒pcep4-m2l、pep4 e02s em2k、pep4 e02s en2k、pep4 e02s et2k的用量均设置在0.1-1.5 ug。

12.一种将外周血单个核细胞（pbmc）重编程为诱导性多能干细胞的方法，包括如权利要求1-11任一项重编程系统方式获取。

13.包含如权利要求12所述的重编程系统的试剂盒。

14.如权利要求12所述的重编程系统方式或如权利要求14所述的试剂盒用于诱导外周血单个核细胞（pbmc）重编程为人诱导性多能干细胞的用途。

技术总结
本发明涉及细胞技术领域，具体涉及一种从外周血单核细胞重编程获得的诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞是通过外周血单个核细胞重编程直接电转获取，本发明有益效果为：重编程效率较高且获取的iPSC细胞纯度高，并整个重编程周期短，提高了效率，适于推广应用。

技术研发人员：王嘉显,林敏,潘芷伊,王莲慧
受保护的技术使用者：南京艾尔普再生医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6