一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的引物及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体dna的引物及其应用。

背景技术：

1、酸奶是人们喜爱的一种营养饮料。酸奶生产的核心是利用乳酸菌发酵，通常采用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行联合发酵。危害酸奶生产的一个重要因素是乳酸菌易感染噬菌体而导致发酵失败。一旦发酵失败轻则使品质下降、风味变差，重则使产酸终止、产品废弃，导致巨大经济损失。噬菌体（bacteriophage）是感染细菌的一种病毒，它分布广泛，各种乳酸菌都容易被其种属特异性的噬菌体感染。在乳制品生产企业，噬菌体不仅天然存在于生牛乳、乳清液等原料奶中，在车间的天棚和墙壁、设备表面、生奶储罐、奶槽车、水池、下水道，以及污垢与灰尘中均有分布。尽管车间消毒和轮换发酵菌是防止噬菌体污染的重要手段，但是在生产过程中对噬菌体进行监测并及时采取对策仍是必要措施。

2、检测噬菌体的传统方法是双层琼脂平板法，但该方法耗时长，敏感性差，在时效上不能满足发酵生产的要求。通过pcr和qpcr进行噬菌体dna检测是快速灵敏特异的最佳方法。由于同一亚群不同毒株的噬菌体其基因组都变异很大，不仅同源区少，让引物设计困难，而且往往无法找到三段距离接近且合适的保守序列用来设计基于taqman探针法的荧光pcr检测引物和探针。因此，许多乳酸菌的相应噬菌体检测只能用一对正向和反向引物，建立基于电泳分析的常规pcr或基于嵌合染料的实时荧光pcr方法。可是，非探针法的嵌合染料实时荧光pcr与探针法相比存在方法学缺陷，即使引物设计的很特异，但是由于引物二聚体、发夹结构和非特异扩增非常容易发生，几乎无法避免，这种非目的片段的dna双链也会嵌合大量染料分子，从而导致荧光信号增长并呈现出假阳性结果。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体dna的引物。

2、本发明还提出一种具有上述引物的试剂盒。

3、本发明还提出上述引物和试剂盒的应用。

4、本发明还提出一种保加利亚乳杆菌噬菌体的检测方法。

5、根据本发明的一个方面，提出了一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体dna的引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq idno:1所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no:2所示；所述引物的核苷酸序列中至少存在一个锁核酸。

6、在本发明的一些实施方式中，所述正向引物的5'端的第12、17位核苷酸为锁核酸。

7、在本发明的一些实施方式中，所述反向引物的5'端的第11、19位核苷酸为锁核酸。

8、在本发明的一些实施方式中，所述正向引物的5'端标记有淬灭基团。

9、在本发明的一些实施方式中，所述淬灭基团为dabcyl、bhq1和mgb中的任一种。

10、在本发明的一些实施方式中，所述淬灭基团为dabcyl。

11、根据本发明的第二方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒含有上述引物。

12、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括荧光pcr反应混合液和dmso。

13、在本发明的一些实施方式中，所述荧光pcr反应混合液为sybr green pro taq hspremix ⅱ。

14、根据本发明的第三方面，提出了上述引物和试剂盒的应用，所述应用为在制备检测保加利亚乳杆菌噬菌体的试剂中的应用。

15、根据本发明的第四方面，提出了一种保加利亚乳杆菌噬菌体的检测方法，所述方法包括以下步骤：采用上述引物或试剂盒对待测样本进行检测。

16、在本发明的一些实施方式中，所述检测采用荧光定量pcr进行。

17、在本发明的一些实施方式中，所述引物在所述荧光定量pcr的反应体系中的终浓度约为0.25μm。

18、在本发明的一些实施方式中，所述dmso在所述荧光定量pcr的反应体系中的终浓度约为2.5%。

19、在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量pcr的扩增反应体系为：

20、荧光pcr反应混合液2×1×；

21、上下游引物0.25μm；

22、dmso2.5%；

23、待检测样品2-4µl；

24、ddh2o补足至20μl。

25、在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量pcr的扩增程序为：95°c预变性2-5min；然后进入循环阶段：95℃变性3-8s，60℃复性和延伸20-40s，40个循环，60°c采集荧光数据。

26、在本发明的一些实施方式中，所述检测后，还包括对样本的ct值进行统计，进行结果判读的步骤；所述结果判读为：

27、阳性：如果样本的ct值≤35，则样本为阳性；

28、阴性：如果样品无荧光增幅现象，则样本为阴性；

29、如果样本的ct值介于35和40之间，需要重新检测，若重新检测的ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，则判为阳性。

30、根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明通过创造性设计筛选获得一对用于检测保加利亚乳杆菌噬菌体dna的高特异性引物，所述引物序列的设计通过将核苷酸选择性用锁核酸替换，以增加引物二聚体或发夹结构之间双链部位的互斥性，同时又能提高引物与模板互补配对的特异性和结合强度；并且正向引物5’端还标记有荧光淬灭基团dabcyl，可以淬灭引物二聚体和发夹结构形成短双链而嵌合的荧光分子，进一步避免假荧光信号，实现双重保障；同时本发明还对检测保加利亚乳杆菌噬菌体dna的反应体系进行了优化，通过上述引物的设计改造和反应体系优化，极大提高了检测特异性，解决了非探针的嵌合染料实时荧光pcr技术的方法学缺陷问题。本发明检测保加利亚乳杆菌噬菌体的方法操作简便、快速，检测特异性强、灵敏度高，结果稳定可靠、成本低廉，适合于酸奶发酵工业中对各种原料奶、发酵中的产品和环境样品的检测，有利于快速检出噬菌体污染情况并采取有效及时的防治措施。本发明的方法在核酸检测领域具有通用性。

技术特征：

1.一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体dna的引物，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq idno:1所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no:2所示；所述引物的核苷酸序列中至少存在一个锁核酸。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正向引物的5'端的第12、17位核苷酸为锁核酸。

3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述反向引物的5'端的第11、19位核苷酸为锁核酸。

4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正向引物的5'端标记有淬灭基团。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1-4任一项所述的引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光pcr反应混合液和dmso。

7.权利要求1-4任一项所述的引物和权利要求5-6任一项所述的试剂盒中的至少一种在制备检测保加利亚乳杆菌噬菌体的试剂中的应用。

8.一种保加利亚乳杆菌噬菌体的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：采用权利要求1-4任一项所述的引物或权利要求5-6任一项所述的试剂盒对待测样本进行检测。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测采用荧光定量pcr进行。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量pcr的扩增程序为：95°c预变性2-5min；然后进入循环阶段：95℃变性3-8s，60℃复性和延伸20-40s，40个循环，60°c采集荧光数据。

技术总结
本发明公开了一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的引物及其应用；所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述引物的核苷酸序列中至少存在一个锁核酸。本发明制备得到的引物通过设计改造和反应体系优化，极大提高了检测特异性，解决了非探针的嵌合染料实时荧光PCR技术的方法学缺陷问题。本发明检测保加利亚乳杆菌噬菌体的方法操作简便、快速，检测特异性强、灵敏度高，结果稳定可靠、成本低廉，适合于酸奶发酵工业中对各种原料奶、发酵中的产品和环境样品的检测，有利于快速检出噬菌体污染情况并采取有效及时的防治措施。

技术研发人员：莫秋华,王炳志,谢本华,杨波,付辉,朱宏基,陈智英,朱海
受保护的技术使用者：深圳市易瑞生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14