紫外分光光度法测定GOD活性的方法

本发明涉及god活性测定，具体为紫外分光光度法测定god活性的方法。

背景技术：

1、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，god)是一种高效高度专一的生物催化剂，广泛存在于动物、植物和微生物体内，微生物中的主要生产菌株有黑曲霉和青霉。在god生产、使用和研发过程中，需要不定期进行酶活性检测，目前常用检测方法有滴定法、电化学法和连续分光光度法，上述方法均因其稳定差、灵敏度不高、过程复杂等不足而难以推广，限制了其在医药卫生领域的应用。因此建立一种高效、快速、实用、低成本的检测方法，是god研发生产中迫切要解决的问题。

2、“惠瑶瑶，郑斐，王倩楠等.一种检测god活力的新方法[j].食品与发酵工业，2020,46(09):255-259”最新开发建立了一种新的god活性测定方法：碘－淀粉分光光度法。以葡萄糖为底物，利用god专一性催化氧化作用生成中间产物h2o2，再通过碘－淀粉分光光度法定量测定h2o2含量，进而计算god活性，体系吸光值有效范围在0.1～0.6附近，god活性测定范围为0.1～0.5u/ml，相对偏差小于5％。这是一种较实用的检测方法，然而大家却忽略这样一个事实，h2o2/ki氧化反应产物碘本身在紫外288nm波长处有强吸收，h2o2(碘)表观摩尔吸光系数是碘－淀粉结合物的1.58倍，达到3.57×104l/(mol·cm)，体系有效吸光度上限扩展到2.0附近，而且有良好的光稳定性，但此种方法操作过程过于复杂，影响检测结果的效率。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了紫外分光光度法测定god活性的方法，解决了现有的检测方法操作过程过于复杂，影响检测效率的问题。

3、(二)技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：紫外分光光度法测定god活性的方法，具体包括以下步骤：

5、s1.仪器试剂预备

6、预备紫外可见分光光度计，god工作液、god标准液、h2o2标准溶液、葡萄糖溶液、0.05mo l/lki、3mo l/lh2so4、0.05mo l/l磷酸盐缓冲液，且葡萄糖、磷酸盐缓冲液、蒸馏水在实验前37℃预热20mi n；

7、s2.酶活度测定

8、在10ml比色管中加入0.1mo l/l葡萄糖1.00ml，用微量取样器准确取god样品液100μl与其混合，加磷酸盐缓冲液2.00ml，37℃温育30mi n后立即加入3mo l/lh2so4溶液0.50ml终止酶催化反应，加入0.05mo l/lki溶液1.00ml，40℃恒温继续反应20mi n，蒸馏水定容至刻度线，蒸馏水作参比，在1cm吸收池中测定288nm波长处测定吸光度a，同步完成酶空白试验；

9、s3.曲线分析

10、按照步骤s2的实验方法，以蒸馏水为参比，分别对葡萄糖、ki、h2o2及h2o2/ki溶液进行紫外光谱扫描；

11、s4.测定波长及h2o2工作曲线方程

12、用1×10—3mo l/lh2o2标准液代替酶反应液，同时改变标准液加入量，按照步骤s2中实验方法完成反应并定容，反应液中h2o2浓度依次为0.00μmo l/ml、0.01μmo l/ml、0.02μmo l/ml、0.03μmo l/ml、0.04μmo l/ml、0.05μmo l/ml，以蒸馏水为参比，在此对反应液作全波长扫描；

13、s5.h2o2/ki氧化反应条件优化

14、用1×10—3mo l/lh2o2标准液0.50ml代替酶催化反应液，采用单因素法考察反应酸度、反应温度、反应时间及ki用量对h2o2/ki反应体系的影响；

15、s6.酶催化反应条件优化

16、进行底液葡萄糖体积的确定、酶催化氧化反应时间考察和酶催化反应终止剂选择。

17、s7.酶样共存物质的干扰

18、取5.25×10-2u/mlgod标准液100μl，实验考察常见共存物质的干扰情况。

19、s8.方法验证

20、进行线性实验和精密度实验。

21、优选的，所述步骤s1中试剂详细的为god工作液：2.50×10—3mg/ml；god标准液：5.25×10-2u/ml；h2o2标准溶液：1.00μmo l/ml；葡萄糖溶液：0.1mo l/l；0.05mo l/lki，3mol/lh2so4，0.05mo l/l磷酸盐缓冲液。

22、优选的，所述步骤s6中底液葡萄糖体积的确定为取5.25×10-2u/mlgod标准液100μl，0.1mo l/l葡萄糖溶液作为底物，改变其体积，步骤s2方法测定吸光度。

23、优选的，所述步骤s6中酶催化氧化反应时间考察为取5.25×10-2u/mlgod标准液100μl，仅改变酶催化氧化反应时间，按步骤s2方法测定吸光度。

24、优选的，所述步骤s8中线性实验为配制0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08u/mlgod标准系列，按步骤s1中方法测定酶活性。

25、优选的，所述步骤s8中精密度实验为连续10次对2.5×10—3mg/mlgod工作液活性进行测定。

26、(三)有益效果

27、本发明提供了紫外分光光度法测定god活性的方法。具备以下有益效果：

28、本发明提供了紫外分光光度法测定god活性的方法，本发明依据紫外分光光度法测定god活性的机理在o2充足条件下，god催化氧化葡萄糖产生葡萄糖酸和h2o2，硫酸及时终止酶催化反应，god催化葡萄糖氧化产生的h2o2与ki作用形成可溶性碘(i2)，碘在紫外光区288nm处的吸光度与h2o2浓度成正比，与一定时间段内god催化氧化反应速度成正比，据此先测定h2o2，进而推算god活性，从而使得本发明的研究依托h2o2/ki反应产物紫外光谱特性直接测定god活性，过程更为简化，288nm最大吸收波长处，god最低检出量为u，god活性检测限达到u/ml，酶活力单位规定为：37℃条件下，1min内催化葡萄糖反应产生1μmolh2o2所需的酶量为1u，酶活性单位用u/ml表示。

技术特征：

1.紫外分光光度法测定god活性的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的紫外分光光度法测定god活性的方法，其特征在于：所述步骤s1中试剂详细的为god工作液：2.50×10—3mg/ml；god标准液：5.25×10-2u/ml；h2o2标准溶液：1.00μmol/ml；葡萄糖溶液：0.1mol/l；0.05mol/lki，3mol/lh2so4，0.05mol/l磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的紫外分光光度法测定god活性的方法，其特征在于：所述步骤s6中底液葡萄糖体积的确定为取5.25×10-2u/mlgod标准液100μl，0.1mol/l葡萄糖溶液作为底物，改变其体积，步骤s2方法测定吸光度。

4.根据权利要求1所述的紫外分光光度法测定god活性的方法，其特征在于：所述步骤s6中酶催化氧化反应时间考察为取5.25×10-2u/mlgod标准液100μl，仅改变酶催化氧化反应时间，按步骤s2方法测定吸光度。

5.根据权利要求1所述的紫外分光光度法测定god活性的方法，其特征在于：所述步骤s8中线性实验为配制0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08u/mlgod标准系列，按步骤s1中方法测定酶活性。

6.根据权利要求1所述的紫外分光光度法测定god活性的方法，其特征在于：所述步骤s8中精密度实验为连续10次对2.5×10—3mg/mlgod工作液活性进行测定。

技术总结
本发明提供紫外分光光度法测定GOD活性的方法，涉及GOD活性测定技术领域。该紫外分光光度法测定GOD活性的方法，具体包括以下步骤：S1.仪器试剂预备；S2.酶活度测定；S3.曲线分析；S4.测定波长及H2O2工作曲线方程；S5.H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;/KI氧化反应条件优化；S6.酶催化反应条件优化；S7.酶样共存物质的干扰；S8.方法验证。本发明提供紫外分光光度法测定GOD活性的方法，该紫外分光光度法测定GOD活性的方法依据紫外分光光度法测定GOD活性的机理，从而使得本发明的研究依托H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;/KI反应产物紫外光谱特性直接测定GOD活性，过程更为简化。

技术研发人员：姚彦红,张爱菊,董娜,张小林
受保护的技术使用者：甘肃医学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15