评价病原微生物检测探针捕获效率的方法及应用与流程

本发明涉及基因检测，特别是涉及一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法及应用。

背景技术：

1、在常规基因检测实验过程中，建立对照组和进行重复实验是最基本和常用的评价探针捕获富集效率的方法。其中，对照组可以采用包括不富集或者富集非目标dna的样本组进行对比评估，而重复实验可以通过比较多次实验的结果来评估探针捕获富集效率的稳定性和可靠性。此外，如控制dna浓度、检测dna碎片长度和使用qpcr等方法也都可以监控富集效率。

2、总体而言，评价探针捕获富集效率的技术比较成熟，多种方法可以结合使用，以获得更准确和可靠的结果。但在实际应用中，仍然需要根据具体实验设计和实验目的选择适当的方法，并注意技术细节和质量控制，以确保结果的准确性和可靠性。

3、但上述现有技术都需额外新增实验环节，使实验流程更加复杂，不仅仅增加了检测成本，而且可能会引入新增实验带来的系统偏差。而临床病原微生物检测，对于检测时效性要求又极为严格，常规技术均存在新增实验环节而延长检测结果交付时间的问题。

技术实现思路

1、基于此，有必要针对上述常规实验中评价探针捕获效率方法需要新增实验的问题，提供一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，

2、一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，包括以下步骤：

3、探针设计：针对目标病原微生物基因序列设计病原探针；以宿主基因中特异且保守的区域为宿主探针区域设计特异性探针，作为内参探针；所述内参探针与所述病原探针遵循相同的设计原则；

4、建库测序：取待测样本，构建测序文库，将文库与所述病原探针和所述内参探针混合，进行杂交捕获反应，并对文库进行高通量测序；

5、数据分析：取测序数据，比对至宿主基因序列，获得比对至宿主探针区域的reads数和比对至宿主非探针区域的reads数，计算比对至宿主探针区域的reads数与比对至宿主非探针区域的reads数的比值，以该比值评价探针捕获效率。

6、上述评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，在针对目标病原微生物设计捕获探针的同时，也针对宿主基因中特异且保守的区域设计特异性探针，作为内参探针，由于内参探针与病原探针遵循相同的设计原则，因此内参探针的捕获效率可反应病原捕获效率，此外内参探针在不同样本和条件下的表达水平相对稳定，更加有利于对病原捕获效率的评价。因此，后续可以此内参探针为指征，通过对比该内参探针对宿主序列的捕获效率，评价病原微生物检测探针捕获效率，从而可避免额外新增实验，缩短了结果交付时间。

7、在其中一个实施例中，所述宿主探针区域和所述宿主非探针区域选自不同的管家基因。可以理解的，宿主探针区域选择特异且保守的区域即可，但选择管家基因具有普遍表达、稳定表达和物种保守性的优势，即管家基因的表达对于基本的细胞功能是必需的，不仅限于特定的发育阶段或特殊的细胞类型；且在正常生理条件下表达水平相对稳定；以及在不同物种中高度保守；有利于后续捕获效率的计算。

8、在其中一个实施例中，所述数据分析步骤中，所述比对至宿主探针区域的reads数为比对至一个管家基因的reads数，所述比对至宿主非探针区域的reads数为比对至另一个管家基因的reads数。

9、在其中一个实施例中，所述管家基因选自gapdh，actb，b2m，fth1，ftl中的至少一个。

10、在其中一个实施例中，对所述比值进行log10标准化，定义为富集效率指数，以此富集效率指数评价探针捕获效率。通过对该比值进行log10标准化，可提高指数的稳定性，不容易受到临床样本病原浓度变化的影响。

11、在其中一个实施例中，该方法还包括阈值设定步骤，所述阈值设定步骤为：取若干临床样本，按照上述方法计算得到富集效率指数，评估富集效率指数对所述临床样本包含的病原阳性率的影响情况，设定富集效率指数阈值。可以理解的，可通过分析大量历史临床样本，考察富集效率指数对病原阳性率的影响情况，并基于分析结果，设定富集效率指数阈值，从而可在个别样本检测时直接参考阈值，减少了方法建立后的运行成本。

12、可以理解的，上述考察富集效率指数对病原阳性率的影响情况，可优先考虑临床上较为核心的致病病原微生物。

13、本发明还公开了上述的内参探针在制备用于病原微生物基因检测的试剂中的用途。

14、常规病原微生物基因检测过程中，宿主序列为“杂质”干扰成分，本案突破常规思维的限制，针对宿主序列设计内参探针，可在无需额外进行实验操作的前提下，方便快捷的计算得到病原探针捕获效率，从而实现病原微生物检测质控。

15、本发明还公开了一种用于病原微生物基因检测的试剂，包括上述的内参探针和病原探针。可以理解的，上述内参探针和病原探针按照常规捕获探针设计规则设计即可。

16、本发明还公开了上述的评价探针捕获效率的方法在病原微生物基因检测中的用途。

17、本发明还公开了一种非诊断治疗目的的病原微生物基因检测方法，包括上述的评价探针捕获效率的方法，还包括捕获效率质控步骤，所述捕获效率质控步骤为：将待测样本的富集效率指数与富集效率指数阈值相比较，当待测样本的富集效率指数高于富集效率指数阈值，则判定为捕获效率合格。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、本发明的一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，在针对目标病原微生物设计捕获探针的同时，也针对宿主基因中特异且保守的区域设计特异性探针，作为内参探针，后续以此内参探针为指征，通过对比该内参探针对宿主序列的捕获效率，可评价病原微生物检测探针捕获效率，从而可避免额外新增实验，缩短了结果交付时间。

技术特征：

1.一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的评价探针捕获效率的方法，其特征在于，所述宿主探针区域和所述宿主非探针区域选自不同的管家基因。

3.根据权利要求2所述的评价探针捕获效率的方法，其特征在于，所述数据分析步骤中，所述比对至宿主探针区域的reads数为比对至一个管家基因的reads数，所述比对至宿主非探针区域的reads数为比对至另一个管家基因的reads数。

4.根据权利要求1所述的评价探针捕获效率的方法，其特征在于，所述管家基因选自gapdh，actb，b2m，fth1，ftl中的至少一个。

5.根据权利要求1所述的评价探针捕获效率的方法，其特征在于，对所述比值进行log10标准化，定义为富集效率指数，以此富集效率指数评价探针捕获效率。

6.根据权利要求5所述的评价探针捕获效率的方法，其特征在于，还包括阈值设定步骤，所述阈值设定步骤为：取若干临床样本，按照上述方法计算得到富集效率指数，评估富集效率指数对所述临床样本包含的病原阳性率的影响情况，设定富集效率指数阈值。

7.权利要求1-6任一项所述的内参探针在制备用于病原微生物基因检测的试剂中的用途。

8.一种用于病原微生物基因检测的试剂，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的内参探针和病原探针。

9.权利要求1-6任一项所述的评价探针捕获效率的方法在病原微生物基因检测中的用途。

10.一种非诊断治疗目的的病原微生物基因检测方法，其特征在于，包括权利要求6所述的评价探针捕获效率的方法，还包括捕获效率质控步骤，所述捕获效率质控步骤为：将待测样本的富集效率指数与富集效率指数阈值相比较，当待测样本的富集效率指数高于富集效率指数阈值，则判定为捕获效率合格。

技术总结
本发明涉及一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法及应用，属于基因检测技术领域。该方法包括以下步骤：探针设计：针对目标病原微生物基因序列设计病原探针；针对宿主探针区域设计特异性探针，作为内参探针；建库测序：取待测样本，构建测序文库，将文库与所述病原探针和所述内参探针混合，进行杂交捕获反应，并对文库进行高通量测序；数据分析：取测序数据，比对至宿主基因序列，获得比对至宿主探针区域和宿主非探针区域的reads数，计算二者的比值，以该比值评价探针捕获效率。该方法在无需增加额外实验环节的情况下，通过对宿主探针区域的富集效率间接监控临床病原的富集效率，既节约了检测成本，又不影响检测结果交付的时效性。

技术研发人员：许腾,许详阳,沈杨,李裕华,吴婉婷,廖诗妍,苟雪静,王小锐,李永军
受保护的技术使用者：广州微远基因科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15