一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法

本发明涉及细胞实验领域，具体为一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法。

背景技术：

1、骨关节炎是临床常见的关节退行性疾病，是导致老年人肢体功能障碍的主要原因，主要的病理特征是软骨质的降解和软骨中细胞数目明显减少，软骨基质的合成和分解代谢失调，最终关节软骨被破坏，而软骨中唯一的细胞是软骨细胞，软骨基质主要是由软骨细胞合成和分泌的，因此，软骨细胞的分裂增殖及凋亡的异常在骨关节炎的发病中起到十分重要的作用，补肾方药临床治疗骨关节炎疗效显著。

2、骨关节炎是以关节软骨丢失以及软骨细胞功能降低或丧失为主要特征的一类退行性关节疾病，但软骨的修复是一个复杂的组织学变化过程，软骨细胞在骨关节炎修复中起着十分重要的作用，如何促进软骨细胞的增殖和延缓软骨细胞凋亡，是需要研究的问题，而中医药学在骨关节病的临床治疗中积累了丰富的经验，为了进一步研究中医药延缓软骨退变的作用机理，因此需要设计一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法，包括以下步骤：

4、步骤s1，软骨细胞培养，在进行体外实验前，首先选取合适的细胞系以及实验耗材，细胞系可选择体外培养的从软骨组织中分离出的软骨细胞，实验耗材可选择cck8试剂盒，然后将人软骨细胞以适当的密度接种在培养皿中，并使用适当的培养基进行培养，确保培养条件适宜，包括适当的温度、湿度和co2浓度；

5、步骤s2，通方制备，制备流程包括水煎、过滤、浓缩、除菌等，补肾痹通方的配方为：熟地黄15g、骨碎补15g、黄芪15g、当归12g、牛膝15g、杜仲15g、川芎12g、防风12g、独活12g、地龙9g、鸡血藤15g和红花12g；

6、步骤s3，干预浓度选择，根据补肾痹通方的成分，制备不同浓度的药物，如0.390625ug/ml、0.78125ug/ml、1.5625ug/ml、3.125ug/ml、6.25ug/ml、12.527ug/ml、25ug/ml和50ug/ml；

7、步骤s4，细胞实验，将不同浓度的补肾痹通方添加到培养皿中含有人软骨细胞的培养基中，以使其达到所需的最终浓度，同时依据实验需要设置对照组、模型组和治疗组，只添加相同量的培养基而不添加补肾痹通方；

8、实验流程为：在合适的培养条件下，如37℃、5％co2，然后将不同浓度的药物加入培养基中，依据实验要求进行细胞培养，将不同浓度的补肾痹通方如0.390625ug/ml、0.78125ug/ml、1.5625ug/ml、3.125ug/ml、6.25ug/ml、12.527ug/ml、25ug/ml和50ug/ml等分别干预人关节软骨细胞，然后将混合后的培养皿放置在细胞培养箱中，以适当的温度和co2浓度进行培养，培养时间可以根据需要进行调整，通常在数小时到数天之间；

9、步骤s5，细胞评估，通过细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞非特异性刺激响应等方面，检测不同浓度补肾痹通方对人软骨细胞的干预效果，如mtt、cck-8、流式细胞术、实时荧光定量pcr等方法，检测不同浓度的药物对人软骨细胞的干预效果，确定药物最佳干预浓度，通过cck8检测细胞增殖抑制状态，计算ic50，依据计算得出的ic50值三分之一浓度向下以3倍数递减设置8个浓度，直到发现有效的软骨细胞增殖的临界值，确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳药物干预浓度等；

10、步骤s6，数据分析，再将各个浓度组的结果与对照组进行比较，分析细胞的生存、增殖、分化或其他相关指标的变化，通过比较不同浓度组的效果，可以进一步确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳的干预浓度，同时分析实验数据，以便进一步的研究；

11、进一步的，所述步骤s1中，对于软骨细胞而言，可以进行软骨特异性基因表达的检测，如胶原型ii、骨形成蛋白等，以评估补肾痹通方对软骨细胞分化的促进作用；

12、进一步的，所述步骤s2中，一般来说，可以选择从较低浓度开始，逐渐增加浓度，以确定对人软骨细胞具有最佳效果的干预浓度范围；

13、进一步的，所述步骤s5中，通过分子生物学技术，如实时定量pcr、免疫印迹等，检测与细胞增殖、凋亡、分化等相关的基因表达水平或蛋白质表达水平的变化，这些分析可以提供更详细的了解补肾痹通方对人软骨细胞的作用机制；

14、进一步的，所述步骤s5中，使用细胞增殖试剂，如mtt、cck-8等对不同浓度组的细胞进行增殖分析，这些试剂可以评估细胞的代谢活性和增殖能力，通过测量吸光度或荧光强度来获得细胞增殖的相对程度。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

16、1、本发明通过cck8检测细胞增殖抑制状态，计算ic50，依据计算得出的ic50值三分之一浓度向下以3倍数递减设置8个浓度，直到发现有效的软骨细胞增殖的临界值，确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳药物干预浓度等；

17、2、本发明将各个浓度组的结果与对照组进行比较，分析细胞的生存、增殖、分化或其他相关指标的变化，通过比较不同浓度组的效果，可以进一步确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳的干预浓度，同时分析实验数据，以便进一步的研究；

18、3、本发明通过分子生物学技术，如实时定量pcr、免疫印迹等，检测与细胞增殖、凋亡、分化等相关的基因表达水平或蛋白质表达水平的变化，这些分析可以提供更详细的了解补肾痹通方对人软骨细胞的作用机制。

技术特征：

1.一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法，其特征在于：所述步骤s1中，对于软骨细胞而言，可以进行软骨特异性基因表达的检测，如胶原型ii、骨形成蛋白等，以评估补肾痹通方对软骨细胞分化的促进作用。

3.根据权利要求1所述的一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法，其特征在于：所述步骤s2中，一般来说，可以选择从较低浓度开始，逐渐增加浓度，以确定对人软骨细胞具有最佳效果的干预浓度范围。

4.根据权利要求1所述的一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法，其特征在于：所述步骤s5中，通过分子生物学技术，如实时定量pcr、免疫印迹等，检测与细胞增殖、凋亡、分化等相关的基因表达水平或蛋白质表达水平的变化，这些分析可以提供更详细的了解补肾痹通方对人软骨细胞的作用机制。

5.根据权利要求1所述的一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法，其特征在于：所述步骤s5中，使用细胞增殖试剂，如mtt、cck-8等对不同浓度组的细胞进行增殖分析，这些试剂可以评估细胞的代谢活性和增殖能力，通过测量吸光度或荧光强度来获得细胞增殖的相对程度。

技术总结
本发明公开了一种确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳干预浓度的方法，包括以下步骤：软骨细胞培养，将人软骨细胞以适当的密度接种在培养皿中；通方制备，制备流程包括水煎、过滤、浓缩、除菌等；干预浓度选择，制备不同浓度的药物；细胞实验，将不同浓度的补肾痹通方添加到培养基中，以使其达到所需的最终浓度；细胞评估，检测不同浓度补肾痹通方对人软骨细胞的干预效果；数据分析，分析细胞的生存、增殖、分化或其他相关指标的变化。本发明通过CCK8检测细胞增殖抑制状态，计算IC50，依据计算得出的IC50值三分之一浓度向下以3倍数递减设置8个浓度，直到发现有效的软骨细胞增殖的临界值，确定补肾痹通方对人软骨细胞最佳药物干预浓度等。

技术研发人员：方锐,向文远,邓迎杰,梁治权,李雷疆,常红,张凯,郭浩,热米拉·艾买提
受保护的技术使用者：新疆医科大学第四附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15