双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物及其制备方法

本发明属于药物代谢和生物合成领域，具体涉及双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物及其制备方法。

背景技术：

1、双氢青蒿素是国际一线抗疟药物，其在体内具有快速、广泛代谢的特点。代谢产物体内作用不明晰一直是制约该类药物作用机制研究的一个重要因素。既往研究主要借助液相-质谱联用技术，预测体内代谢产物，而缺乏实际获得代谢产物以进一步开展药效作用评价的有效途径。小克银汉霉因具有与人相似的cyp 450s而被公认为可以高效模拟人体代谢过程的微生物模型。asha s,cunninghamella--a microbial model for drug metabolismstudies--a review.biotechnol adv,2009,27(1):16-29.doi:10.1016/j.biotechadv.2008.07.005.报道小克银汉霉属的菌种具有与人类相似的细胞色素p450酶，具有模拟体内代谢过程的能力。与小鼠、微粒体等代谢研究模型相比，微生物模型具有更加绿色、廉价、避免实验动物伤害等优点，且直接模拟人体代谢，避免了不同物种模型间产物差异。双氢青蒿素体内代谢产物含量及低，难以直接获得产物单体并开展活性评价研究。现有技术中未有体外制备双氢青蒿素大鼠血液代谢产物的方法，因此寻找能够大量制备双氢青蒿素代谢产物的方法成了本领域技术难题。

技术实现思路

1、双氢青蒿素进入体内后会产生一系列代谢产物，药物体内代谢产物含量低，且在红细胞内发挥抗疟疗效，难以直接分离得到代谢产物单体。基于此，为阐明双氢青蒿素红细胞内药效物质基础，本发明设计了一种通过微生物制备双氢青蒿素红细胞内代谢产物的方法，为制备难以获得的体内活性代谢产物提供了一种绿色、廉价、操作便捷的有效方法。通过该方法所获得的双氢青蒿素红细胞内代谢产物具有与青蒿素相当的抗疟活性。

2、一种双氢青蒿素红细胞内代谢产物的制备方法，其步骤包括：首先通过对比大鼠口服双氢青蒿素的体内代谢产物和微生物菌种转化产物对比，筛选合适的模拟代谢菌种。确定cunninghamella elegans atcc 9245作为转化模型，采用二级培养法得到菌种的发酵液；然后加入双氢青蒿素进行转化培养，获得转化产物(即双氢青蒿素红细胞内代谢产物)，测定转化产物抗疟活性，评价微生物转化产物与红细胞内代谢产物一致性。

3、本发明制备的双氢青蒿素代谢产物的结构如下式所示：

4、

5、1.本申请公开筛选模拟体内代谢的微生物转化模型菌种的方法为：

6、采用uplc-ms联用技术，分别检测大鼠服用双氢青蒿素后的血液样品和多个微生物菌种转化双氢青蒿素的菌种转化液。通过对比两者产物的色谱行为，包括产物的保留时间、分子离子峰及裂解碎片等特征，筛选微生物菌种cunninghamella elegans atcc 9245为最优转化模型，用于体外代谢产物制备。

7、2.本申请公开制备双氢青蒿素红细胞内代谢产物的方法为：

8、采用cunninghamella elegans atcc 9245制备双氢青蒿素红细胞内代谢产物。

9、(1)菌种的二级培养：将菌种cunninghamella elegans atcc 9245接种于pda平板固体培养基中培养48h，将其转移至液体培养基，180r/min，28℃恒温培养48h，得到ⅰ级种子培养液。将ⅰ级种子培养液转移至装有ⅱ级转化培养液的发酵瓶中，转种率为10％，180r/min，28℃恒温培养48h，得到ⅱ级转化培养液。

10、(2)加底物转化培养并制备转化产物：以双氢青蒿素为转化底物，采用甲醇为底物溶剂，将该溶液加入ⅱ级转化培养液中，使得发酵体系中底物终浓度为0.5mg·ml-1。28℃恒温培养，180r/min培养14天。发酵液通过乙酸乙酯溶液(1:1，v/v)重复萃取，减压回收，得到转化产物粗提物(即发酵液乙酸乙酯部位粗提物)。

11、(3)转化产物的分离：取转化产物粗提物利用sepabeantm machine型快速分离硅胶制备色谱，chormatorex硅胶柱层析，sepabeantm machine型快速分离c18柱层析分离，得到化合物通过核磁、质谱等方法确认其结构为7β-hydroxy-dihydroartemisinin(d1)和5α-hydroxy-dihydroartemisinin(d4)。

12、3.本申请公开转化产物抗疟活性的测定方法为：

13、抗疟活性评价以恶性疟原虫plasmodium falciparum 3d7(pf.3d7)为模型，采用sybr greenⅰ荧光检测法对d1和d4进行疟原虫体外抑制活性评价，检测结果表明化合物d1和d4抗疟活性ic50值分别为47.15nmol·l-1和93.80nmol·l-1，与青蒿素具有相同数量级的ic50抑制浓度。

14、4.本申请公开微生物转化产物与体内代谢产物一致性评价方法为：

15、采用uplc-ms技术对比双氢青蒿素微生物转化产物7β-hydroxy-dihydroartemisinin(d1)和5α-hydroxy-dihydroartemisinin(d4)与大鼠体内代谢产物，色谱行为及质朴特征一致。

16、5.通过微生物转化的方法制备了双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物，该方法应用于体内活性代谢产物制备的应用。

17、6.一种双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物7β-hydroxy-dihydroartemisinin和5α-hydroxy-dihydroartemisinin在抗疟疗效的应用。

18、本发明的优点如下：

19、(1)本发明获得的双氢青蒿素转化产物保留了母核中的过氧桥结构，具有良好的抗疟活性。

20、(2)本发明采用微生物转化模型获得双氢青蒿素体内代谢产物，绿色环保、工艺简单，避免使用动物模型，经济实用。

21、(3)本发明获得d1和d4与大鼠口服双氢青蒿素后血液(包括全血、血浆、红细胞)中的代谢产物一致，为研究双氢青蒿素红细胞内活性药效物质提供科学依据。

技术特征：

1.一种双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：首先通过对比大鼠口服双氢青蒿素的体内代谢产物和微生物菌种转化产物，筛选出模拟代谢模型菌种；确定cunninghamella elegans atcc 9245作为转化模型，采用二级培养法得到菌种的发酵液；然后加入双氢青蒿素转化培养，获得转化产物，即双氢青蒿素红细胞内代谢产物，测定转化产物的抗疟活性，评价微生物转化产物与红细胞内代谢产物一致性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物的结构式包括d1和d4；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，建立微生物转化方法模拟双氢青蒿素的体内代谢，其方法为：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，a)全血样品的制备方法为：取全血于离心管，加入重铬酸钾，混匀，加edta-na2溶液；于冰面涡旋1min；置于-80℃冰箱冰冻、0℃融化，涡旋1min，重复3个冻融循环；混合物融化后，于冰水中超声5min；b)血浆样品的制备方法为：取全血于离心管，加入重铬酸钾，混匀，于4℃、3500rpm离心5min，取上清液，加edta-na2溶液，涡旋1min；c)红细胞样品的制备方法：向剩余红细胞中加入生理盐水，于4℃、5000rpm离心1min，弃上清液，向红细胞中加入重铬酸钾、edta-na2溶液，于冰面涡旋1min；置于-80℃冰箱冰冻、0℃融化，涡旋1min，重复3个冻融循环；混合物融化后，于冰水中超声5min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用cunninghamella elegans atcc 9245制备双氢青蒿素红细胞内代谢产物的方法为：cunninghamella elegans atcc 9245双氢青蒿素发酵液经180r/min、28℃恒温培养14天后，用16层纱布过滤，滤液通过乙酸乙酯溶液重复萃取三次，减压回收溶剂，得到转化产物粗提物；然后取所述转化产物粗提物以硅胶柱层析、chormatorex柱层析、sepabeantm machine型快速分离c18柱层析分离，获得产物7β-hydroxy-dihydroartemisinin作为d1，和产物5α-hydroxy-dihydroartemisinin作为d4。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以恶性疟原虫plasmodium falciparum3d7为模型，采用sybr greenⅰ荧光检测法对产物d1和产物d4进行疟原虫体外抑制活性检测。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用lc-ms对比微生物转化产物d1和d4与体内全血、血浆或红细胞代谢产物的一致性。

8.根据权利要求1～7所述的方法，其特征在于，通过微生物转化的方法制备了双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物，该方法应用于体内活性代谢产物制备的应用。

9.双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物，其特征在于，所述双氢青蒿素体内活性代谢产物的结构式包括式d1和式d4；

10.一种根据权利要求9所述的双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物d1和d4在抗疟疗效的应用。

技术总结
本发明公开了双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物及其制备方法，步骤包括：通过对比大鼠口服双氢青蒿素的体内代谢产物和微生物菌种转化产物，筛选合适的模拟代谢模型菌种。确定Cunninghamella elegans ATCC 9245作为转化模型，采用二级培养法得到菌种的发酵液；然后加入双氢青蒿素转化培养，经过柱层析分离，获得双氢青蒿素红细胞内活性代谢产物7β‑hydroxy‑dihydroartemisinin和5α‑hydroxy‑dihydroartemisinin。本发明采提供了一种高效制备难以获得的体内活性代谢产物的微生物转化方法，绿色环保、工艺简单，制备的代谢产物具有与青蒿素相当的抗疟活性。

技术研发人员：马悦,赵一帆,高歆娜,孙鹏,张东,杨岚,高慧敏,康靖杰
受保护的技术使用者：中国中医科学院中药研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16