一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒及应用的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域，更具体地，涉及一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒及应用。

背景技术：

1、头颈部肿瘤是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其起源于口腔、口咽、鼻咽、下咽、喉等部位的黏膜上皮组织，超过90％的癌症为鳞状细胞癌，因此，头颈部不同解剖部位的肿瘤被统称为头颈鳞状细胞癌。据统计，每年约有71万的头颈鳞状细胞癌新发病例和35.9万的死亡病例。对于口腔癌和喉癌患者而言，肿瘤患者可能会因为出现口腔疼痛、长期溃疡、无法饮食或声音嘶哑、构音障碍等症状而就诊，从而促进早期诊断。咽部包括上咽(鼻咽部)、中咽(口咽部)和下咽(喉咽部)，咽部的肿瘤主要包括上咽部肿瘤(鼻咽癌)、中咽部肿瘤(扁桃体癌)和下咽部肿瘤(下咽癌)。咽部的肿瘤由于其解剖位置隐匿，且患者在癌症早期甚至中期几乎都不会出现不适症状，因此，患者因不适而就医时，癌症往往已经发展至晚期，此时，绝大多数病人还伴随有淋巴结转移，预后极差。因此，咽部恶性肿瘤的早诊、早治对于提高患者的存活率和生命质量是十分重要的。

2、头颈部肿瘤(包括咽部恶性肿瘤)通常没有癌前病变的过程，且目前也没有有效的用于头颈部肿瘤筛查的策略，高规格的体检仍然是早期发现的主要方法。对可疑的颈部肿块或病变组织进行细针穿刺、杯钳、切口活检或切除活检是诊断头颈部肿瘤的金标准，其它的影像学检测有利于对恶性肿瘤进行分期。即目前尚无无创的、高灵敏性、高特异性的咽部恶性肿瘤的筛查和早期诊断方法。

3、表观遗传学在恶性肿瘤的发生和发展过程中发挥了重要作用。作为表观遗传的一种，dna甲基化对于癌基因和抑癌基因的转录、表达有着深远影响，异常的dna甲基化的往往导致癌基因和抑癌基因功能紊乱，且其通常发生在癌症的早期；另外，癌变的细胞由于其细胞间黏附分子的表达降低，往往更易脱落或转移，且发生癌变的细胞可通过凋亡、坏死或主动分泌的方式将基因组dna以片段化的方式释放到体液中。因此，理论上，可以通过检测体液样本中某些循环的肿瘤dna的甲基化水平来诊断咽部恶性肿瘤。现阶段，探究能够有效区分咽部恶性肿瘤患者和咽部非癌患者的甲基化分子标志物和诊断方法是急需的。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒及应用，以改善现有技术对于咽部恶性肿瘤的诊断手段不足，对咽部恶性肿瘤检测准确度低，缺少能够有效区分咽部恶性肿瘤患者和非癌患者的分子标志物，缺乏对扁桃体磷癌、鼻咽癌和下咽癌等不同类型的咽部恶性肿瘤的检测等问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂在制备咽部恶性肿瘤检测产品中的应用，以grch38为参考基因组，所述咽部恶性肿瘤分子标志物选自cyp26a1基因的如下区域的全长区域或部分区域：chr10:93074735-93074838正链，和/或chr10:93074948-93075078正链。

3、优选地，所述咽部恶性肿瘤包括扁桃体磷癌、鼻咽癌和下咽癌中的至少一种。

4、优选地，所述咽部恶性肿瘤检测产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。

5、本发明还提供了一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒，以grch38为参考基因组，其包括用于检测chr10:93074735-93074838正链和/或chr10:93074948-93075078正链的甲基化水平的引物对，和/或检测探针。

6、优选地，所述试剂盒包括用于检测chr10:93074735-93074838正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对；

7、和/或，用于检测chr10:93074948-93075078正链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对。

8、进一步优选地，所述第一甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.11～12所示；所述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.13～14所示；所述第二甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.15～16所示；所述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如seq idno.17～18所示。

9、优选地，所述试剂盒包括用于检测chr10:93074735-93074838正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一检测探针；

10、和/或，用于检测chr10:93074948-93075078正链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二检测探针。

11、进一步优选地，所述试剂盒包括如下组合中的至少一组：

12、(1)seq id no.11～12所示的第一甲基化引物对和seq id no.19所示的第一检测探针；

13、(2)seq id no.15～16所示的第二甲基化引物对和seq id no.20所示的第二检测探针。

14、优选地，所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、pcr反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。

15、总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

16、(1)本发明提供的一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒，通过检测样本中cyp26a1基因的chr10:93074735-93074838正链和/或chr10:93074948-93075078正链的甲基化水平，对咽部恶性肿瘤组织样本和血浆样本均具有优异的检测效果，检测准确度高，能够有效区分咽部恶性肿瘤患者和非癌患者。该试剂盒检测咽部恶性肿瘤血浆样本的灵敏性可达83.33％，检测健康人血浆样本的特异性可达95.83％。

17、(2)相较于现有技术，本发明提供的试剂盒对扁桃体鳞癌、鼻咽癌、下咽癌等不同类型的咽部恶性肿瘤均具有较高的检测灵敏性和特异性，其检测扁桃体鳞癌血浆样本的灵敏性达82.61％，检测鼻咽癌血浆样本的灵敏性达86.27％，检测下咽癌血浆样本的灵敏性达77.27％。

18、(3)本发明提供了能够用于咽部恶性肿瘤检测的分子标志物，并提供了一种无创或微创、高灵敏性、高特异性的检测咽部恶性肿瘤的方法，有利于咽部恶性肿瘤的早期检出，并提高患者的生存率。

技术特征：

1.一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂在制备咽部恶性肿瘤检测产品中的应用，其特征在于，以grch38为参考基因组，所述咽部恶性肿瘤分子标志物选自cyp26a1基因的如下区域的全长区域或部分区域：chr10:93074735-93074838正链，和/或chr10:93074948-93075078正链。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述咽部恶性肿瘤包括扁桃体磷癌、鼻咽癌和下咽癌中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述咽部恶性肿瘤检测产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。

4.一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒，其特征在于，以grch38为参考基因组，其包括用于检测chr10:93074735-93074838正链和/或chr10:93074948-93075078正链的甲基化水平的引物对，和/或检测探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测chr10:93074735-93074838正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对；

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述第一甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.11～12所示；所述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.13～14所示；所述第二甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.15～16所示；所述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.17～18所示。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测chr10:93074735-93074838正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一检测探针；

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下组合中的至少一组：

9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测探针的5’端含有荧光报告基团，3’端含有荧光淬灭基团。

10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、pcr反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。

技术总结
本发明属于分子生物学检测领域，更具体地，涉及一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒及应用。本发明提供的用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒，通过检测样本中CYP26A1基因的Chr10:93074735‑93074838正链和/或Chr10:93074948‑93075078正链的甲基化水平，对咽部恶性肿瘤组织样本和血浆样本均具有优异的检测效果，检测准确度高，能够有效区分咽部恶性肿瘤患者和非癌患者。此外，该试剂盒能够对扁桃体鳞癌、鼻咽癌、下咽癌等不同类型的咽部恶性肿瘤进行高灵敏性、高特异性的检测，有利于咽部恶性肿瘤的早期检出，提高患者的生存率。

技术研发人员：周谛晗,张良禄,董兰兰,周俊,万慧,阮彦添
受保护的技术使用者：武汉艾米森生命科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15