将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法与流程

本发明涉及多能干细胞重编程，具体涉及一种更简单高效的将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法。

背景技术：

1、自2006年山中伸弥课题组将小鼠成纤维细胞诱导为多能干细胞后，多能干细胞重编程技术经历了快速的发展，人类来源的体细胞重编程也一步步成功实现，例如俞君英课题组通过转入六个转录因子（oct4、sox2、lin28、nanog、c-myc、klf4）的情况下，将外周血重编程为诱导性多能干细胞，miguel esteban和裴端卿课题组在尿细胞中转入三个转录因子（oct4、sox2、klf4）和micro rna302/367后成功将肾脏上皮细胞重编程为诱导性多能干细胞。2022邓宏魁课题组成功实现了完全小分子重编程的形式将人来源的成纤维细胞重编程为多能干细胞，但其诱导时间过长。

2、在体细胞重编程为诱导多能干细胞这一过程中，细胞的命运发生了剧烈的变化，特征性基因也完成了转变，目前科学家们已经大致的了解了体细胞转变为干细胞后，完全受到抑制的基因和完全激活的基因，我们可以通过添加促进要激活的基因的相关通路的小分子和抑制原来要被沉默的基因相关通路的小分子，从而在少量转录因子的情况下就实现高效稳定的重编程方案。然而，少量转录因子重编程目前研究进程缓慢，仅有的已经报道的方案中依旧存在重复性困难且效率不稳定这一问题，如公开号为cn114645023b的发明专利“将外周血单个核细胞重编程为诱导多能干细胞的系统和方法”其重编程效率仅能达到0.006% 左右，且在多次重复实验中克隆数量相差过大，效率在0.002-0.006%之间摆动，很不稳定，所以为了更深层次的理解不同转录因子在体细胞重编程至胚胎干细胞中所起到的作用，丰富体细胞至胚胎干细胞转变的方案，有必要找到一种效率高效且重复率高，更适合于外周血细胞这种难以转染的细胞类型的重编程方案。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的之一在于提供一种将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，包括以下步骤：在体细胞中仅转入oct4、sox2、lin28三种重编程诱导因子，然后在存在化学诱导剂的条件下培养以得到诱导性多能干细胞，其中，所述化学诱导剂由佩非西替尼、vtp50469、sb203580、fpft-2216组成，佩非西替尼的浓度为0.5~1.5μm，vtp50469的浓度为0.1~1μm，sb203580的浓度为1~3μm，fpft-2216的浓度为1~5μm。

2、作为一种优选的实施方式，所述oct4、sox2、lin28三种重编程诱导因子以其核酸的形式，或者以其蛋白产物的形式导入体细胞中。

3、作为一种优选的实施方式，所述oct4、sox2、lin28三种重编程诱导因子以其dna的形式，或者以其mrna的形式导入体细胞中。

4、作为一种优选的实施方式，所述oct4、sox2、lin28三种重编程诱导因子转入体细胞的形式包括但不限于仙台病毒转染体系、mrna转染体系、附加体质粒转染形式。

5、作为一种优选的实施方式，所述体细胞为外周血来源的造血前体细胞。

6、作为一种优选的实施方式，将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，包括以下步骤:将oct4、sox2、lin28三个转录因子转入到体细胞内，采用含有上述佩非西替尼、vtp50469、sb203580、fpft-2216四种化学诱导剂的诱导培养基进行诱导，最后采用多能干细胞培养基培养至诱导性多能干细胞克隆完全成熟，随后随机挑取克隆进行扩增；其中，所述诱导培养基为添加有2~4μm chir99021、80~120ng/ml fgf2、200~300μm nab、1~3μmsb203580、0.5~1.5μm 佩非西替尼、0.05~0.2μm vtp50469、1~5μm fpft-2216、体积比1~3%b27、体积比1%n2 的多能干细胞培养基；所述多能干细胞培养基为mtesr1培养基。

7、具体地，所述oct4、sox2、lin28三个转录因子通过附加体质粒的电转染形式转入体细胞中，所述附加体质粒为改造后带有上述三个转录因子的pcpe4载体，其中oct4、sox2两个转录因子构建在同一pcpe4载体上。

8、具体地，电转染后，立即加入外周血扩增培养基，并种植于包被过基底膜基质的孔板中，培养46~50h后；加入诱导培养基，继续培养46~50h，随后采用不完全换液的方式加入新的诱导培养基继续诱导46~50h，重复操作1~3次，将旧培养基全部吸弃，加入多能干细胞培养基培养，每天更换多能干细胞培养基，持续至诱导性多能干细胞克隆完全成熟，随时挑取克隆扩增。

9、具体地，外周血扩增培养基为添加有scf 80~120 ng/ml、flt-3 80~120 ng/ml、il-3 10~30 ng/ml、il-6 10~30 ng/ml和tpo 80~120ng/ml的无血清培养基。

10、本发明在三种转录因子和四种小分子抑制剂的作用下将人外周血细胞重编程为诱导性多能干细胞，重编程效率能达到0.02%，比现有技术（专利号为cn114645023b）提升了约3.3倍左右，诱导周期仅有14~16天，且体系稳定。

技术特征：

1.将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：在体细胞中仅转入oct4、sox2、lin28三种重编程诱导因子，然后在存在化学诱导剂的条件下培养以得到诱导性多能干细胞，其中，所述化学诱导剂由佩非西替尼、vtp50469、sb203580、fpft-2216组成，佩非西替尼的浓度为0.5~1.5μm，vtp50469的浓度为0.1~1μm，sb203580的浓度为1~3μm，fpft-2216的浓度为1~5μm。

2.根据权利要求1所述的将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述oct4、sox2、lin28三种重编程诱导因子以其核酸的形式，或者以其蛋白产物的形式导入体细胞中。

3.根据权利要求1所述的将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述oct4、sox2、lin28三种重编程诱导因子以其dna的形式，或者以其mrna的形式导入体细胞中。

4.根据权利要求1所述的将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述oct4、sox2、lin28三种重编程诱导因子转入体细胞的形式包括但不限于仙台病毒转染体系、mrna转染体系、附加体质粒转染形式。

5.根据权利要求1所述的将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述体细胞为外周血来源的造血前体细胞。

6.根据权利要求1~5任一项所述的将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述oct4、sox2、lin28三个转录因子通过附加体质粒的电转染形式转入体细胞中，所述附加体质粒为改造后带有上述三个转录因子的pcpe4载体，其中oct4、sox2两个转录因子构建在同一pcpe4载体上。

8.根据权利要求7所述的将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，电转染后，立即加入外周血扩增培养基，并种植于包被过基底膜基质的孔板中，培养46~50h后；

9.根据权利要求8所述的将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，外周血扩增培养基为添加有scf 80~120 ng/ml、flt-3 80~120 ng/ml、il-3 10~30 ng/ml、il-6 10~30 ng/ml和tpo 80~120ng/ml的无血清培养基。

技术总结
本发明涉及多能干细胞重编程技术领域，具体涉及一种更简单高效的将人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法。该方法通过在体细胞中同时转入OCT4、SOX2、LIN28三种转录因子，然后在佩非西替尼、VTP50469、SB203580、FPFT‑2216四种小分子的共同诱导作用下进行重编程，其外周血重编程效率能达到0.02%、诱导周期仅有14~16天，且体系稳定。

技术研发人员：郭莹,杨一行
受保护的技术使用者：夏同生物科技（苏州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14