一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用与流程

本技术属于生物制品，具体涉及一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用，尤其涉及一种同时缺失cd2v和i177l基因部分片段的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和在疫苗制备中的应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)是非洲病毒科中唯一的非洲病毒属，也是目前唯一的dna虫媒病毒属。该病毒主要靠口或鼻腔直接接触感染，同时拥有多个循环传播方式，主要存在于血液、组织液、内脏、分泌物和排泄物中，具有感染率高，传播迅速，致死率高等特点，对全球养猪业造成了巨大经济损失。

2、针对病毒预防的最主要方法是疫苗接种。然而对于非洲猪瘟病毒，市场上还没有可用的疫苗产品，虽然已经尝试开发了非洲猪瘟病毒灭活疫苗、减毒活疫苗及基因工程疫苗等，但经过效果评价后，均未获得预期的免疫效果。其中灭活疫苗无法使动物体内产生中和抗体，因此不能产生抵抗强毒攻击的免疫力；减毒活疫苗免疫副作用多且易引起多重感染等问题，存在一定的生物安全隐患；通过基因工程制备的dna疫苗可使动物获得一定的免疫保护，但并未检测到相应抗体，推测可能为细胞免疫占主导地位。

3、研究表明，在非洲猪瘟病毒编码的蛋白成分中，很多具有免疫抑制特性，例如已经明确的与免疫抑制有关的基因主要为cd2v、mgf、i177l和9gl等。因此，目前针对非洲猪瘟病毒疫苗的研究主要集中在利用这些免疫抑制基因缺失的毒株作为疫苗株制备疫苗。其中研究较多的为cd2v和mgf基因缺失株，然而cd2v缺失对毒株的毒力影响有限(几乎没有影响)，mgf基因缺失后不同剂量的研究会引起接种猪体温变化，并且会与非洲猪瘟流行毒株发生重组而返回毒性。专利文献cn110551695a(以下称文献1)已公开一种cd2v和mgf基因(mgf360-12l、mgf-13l和mgf-14l)同时缺失的减毒疫苗株，其毒力减弱主要是mgf-360基因缺失导致的，并且可表现出良好的免疫保护作用。然而，利用该文献1公开的基因缺失疫苗株接种仔猪后，仔猪虽然未显示异常不良反应，但会导致仔猪在接种后第2～3天出现短暂的体温升高，最高体温能达到41.3℃，有潜在的安全性问题。

4、另一方面由于mgf基因属于多基因家族，其中的重复序列很容易通过自身突变和同源重组缺失或回补缺失部位而导致毒力返强，并且mgf360-12l、mgf-13l和mgf-14l附近及本身就是一个比较容易重组的片段，现有研究也表明：该病毒的野生毒株在传代细胞上进行传代培养导致的缺失位点、或在自然界中直接分离到的自然缺失株所缺失的位点基本上都在这几个mgf基因附近，例如参见chapman da,tcherepanov v,upton c,dixonlk.2008.comparison of the genome sequences of non-pathogenic andpathogenicafrican swine fever virus isolates.j genvirol 89:397–408；de lavegai,vinuela e,blasco r.1990.genetic variation and multigene families inafricanswine fever virus.virology 179:234-246；krug pw,holinka lg,o’donnell v,reeseb,sanford b,fernandezsainz i,gladue dp,arzt j,rodriguez l,risatti gr,borcamv.2015.the progressive adaptation ofa georgian isolate ofafrican swine fevervirus to vero cells leads to a gradual attenuation ofvirulence in swinecorresponding to major modifications of the viral genome.j virol 89:2324-2332.)。因此，mgf360-12l、mgf-13l和mgf-14l等mgf基因片段的这种极易发生自身突变和同源重组缺失或回补缺失部位的现象，极有可能会造成由上述文献1公开的缺失cd2v和mgf360(12l,13l,14l)基因的疫苗株制备的减毒活疫苗面临潜在的毒力返强安全风险。

技术实现思路

1、鉴于上述背景，本技术希望提供一种毒力强且稳定性好的减毒非洲猪瘟病毒毒株。具体来说，本技术涉及如下内容：

2、1、一种减毒非洲猪瘟病毒毒株，其相对于野生型ii型非洲猪瘟病毒在基因组中缺失以下基因片段：cd2v和i177l基因片段；

3、优选缺失序列与seq id no:1具有至少80％同一性的cd2v基因片段、以及缺失序列与seq id no:2具有至少80％同一性的i177l基因片段；

4、更优选缺失序列如seq id no:1所示的cd2v基因片段、以及序列如seq id no:2所示的i177l基因片段。

5、2、根据项1所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株，其中所述野生型ii型非洲猪瘟病毒为选自下组的任一项：asfv-sy18、georgia 2008/1、pig/hlj/2018、georgia 2007/1、asfvgz2018、asfvanhui 2018、asfv gd 2019、asfv innermongolia 2019。

6、3、根据项1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株的构建方法，其包括以下步骤：通过基因工程手段使野生型ii型非洲猪瘟病毒的cd2v和i177l基因片段缺失。

7、4、根据项3所述的构建方法，其中所述基因工程手段为同源重组技术，其具体包括以下步骤：

8、利用同源重组将包含有cd2v基因的左右同源臂的同源重组转移载体和包含有i177l基因片段的左右同源臂的同源重组转移载体转染所述野生型ii型非洲猪瘟病毒；

9、筛选同时缺失cd2v基因和i177l基因的减毒非洲猪瘟病毒毒株。

10、5、根据项4所述的构建方法，其中，所述方法包括以下步骤：s1)将cd2v基因的左右同源臂和第一筛选表达盒克隆至pbluescript ii ks载体，获得第一同源重组转移载体；

11、s2)将i177l基因片段的左右同源臂和第二筛选表达盒克隆至pbluescript ii ks载体，获得第二同源重组转移载体；

12、s3)将步骤s1)的第一同源重组转移载体用转染试剂转染至使用所述亲本ii型非洲猪瘟病毒感染的原代pam细胞中，通过所述第一筛选表达盒筛选获得缺失cd2v基因的第一重组病毒；

13、s4)将步骤s2)的第二同源重组转移载体用转染试剂转染至使用步骤s3)获得的第一重组病毒感染的原代pam细胞中，通过所述第一筛选表达盒和第二筛选表达盒筛选获得同时缺失cd2v基因和i177l基因的第二重组病毒，作为减毒非洲猪瘟病毒毒株。

14、6、根据项5所述的构建方法，其中所述第一筛选表达盒和所述第二筛选表达盒为不同的筛选表达盒，且选自mcherry和egfp表达盒的任一项。

15、7、根据项1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株的用于制备非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的用途。

16、8、一种非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其由项1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株制备获得。

17、9、根据项8所述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其中的减毒非洲猪瘟病毒的病毒含量≥107.0tcid50/ml。

18、10、根据项8或9所述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：

19、t1)将项1或2所述的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株接种原代细胞，扩大培养，收获病毒液；

20、t2)以病毒含量≥107.0tcid50/ml的病毒液直接或配合佐剂制成疫苗。

21、11、根据项10所述的制备方法，其中所述佐剂选自下组的一项或多项：铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂和聚集体结构佐剂，优选选自下组的一项或多项：白介素或干扰素。

22、本技术的技术方案实现的有益技术效果

23、本技术通过细致研究得出下述结论：专利文献cn113122511b(以下称文献2)已公开一种i177l、cd2v和mgf基因(mgf360-12l、mgf-13l和mgf-14l)同时缺失的减毒疫苗株，其毒力减弱主要是mgf-360基因缺失和i177l基因缺失导致的，且表现出良好的免疫保护作用。然而，mgf基因为多基因家族，本身具有自身复制插入的特点，缺失后可能出现因基因家族中其他基因复制插入而导致缺失基因回补的情况，基因缺失的稳定性较差。其次，据本技术的研究表明，mgf360基因可抑制宿主产生细胞因子，缺失后可能导致被接种动物出现免疫过激或细胞因子风暴，使接种动物因过激的免疫反应而造成器官的伤害。基于以上技术方案提供的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株在cd2v基因缺失的基础上，还缺失了i177l基因部分片段，获得一种相对于野生毒株显著减毒(i177l基因部分片段缺失的减毒效果)、能够高效稳定增殖且病毒滴度较高、保持较高的毒力和免疫原性、种毒稳定性好、并可以区别于野生毒株(利用cd2v基因的缺失)的非洲猪瘟病毒毒株(rasfv gz2018δcd2v/i177l)。经试验证明，利用本技术提供的rasfv gz2018δcd2v/i177l毒株对实验猪进行接种后，按照低剂量(103.0tcid50/头)接种和高剂量(105.0tcid50/头)接种实验猪，均不会出现实验猪体温明显升高(不超过40.3℃)、发病或死亡现象，表现出与文献2公开的基因缺失株相同的安全性，且比文献1和文献3(development ofa highly effectiveafrican swine fevervirus vaccine by deletion of the i177l gene results in sterile immunityagainst the current epidemic eurasia strain，journal ofvirology，2020；doi：10.1128/jvi.02017-19)公开的基因缺失株具有更好的安全性，同时还表现出良好的免疫攻毒保护效果，保护率为100％；另一方面，本技术是i177l毒力基因的缺失，i177l基因在整个基因组中仅有单个基因，其不像多基因家族基因(例如mgf360基因)一样容易被多次复制或重组而发生缺失回补的现象，并且由于i177l基因片段单独缺失时就可以表现出显著的减毒效果，因此本技术提供的基因缺失株消除了毒力返强的潜在风险。