一种鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法

本发明涉及一种鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，属于畜牧学和生物。

背景技术：

1、建立单细胞克隆系是基因编辑和细胞工程过程中的关键步骤，这项技术在细胞生物学和生物医学研究领域中有着重要的意义。随着pgcs介导的遗传改造和模式动物生产等技术的发展，发明适合于鸡pgcs的单克隆细胞制备技术显的尤为重要。建立单细胞克隆系涉及到从一个细胞群体中分离出单个前体细胞并扩增以获得单克隆细胞系。目前，分离单个细胞的方法主要包括流式细胞分选法、有限稀释法和单细胞挑选法等。流式细胞分选法是一种复杂的技术，通常需要流式细胞仪和特定的荧光探针来分选和分离单个细胞。有限稀释法是通过移液器将细胞悬浮液稀释到培养板每个孔只含有一个细胞。但是，这种方法有一定概率会造成少数几个细胞在一个孔中生长的可能性。一旦细胞在孔中扩增，可以筛选所需的克隆进行扩大培养。通常这种隔离方法相对低效且耗费大量人力。但是由于易于使用和减少了对细胞的应激，它仍然广泛应用于细胞工程领域。单细胞挑选需要手工选择或使用特殊机器将单个细胞分离并在培养板中进行扩增。手工选择的方法过程比较简单，适用于实验室工作。例如公开号为cn 109837238 a的中国发明专利，公开了一种鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系建立的方法，技术中的鸡胚胎成纤维细胞是贴壁生长的，而pgcs是呈悬浮生长的，在挑选过程中尤为重要，否则后期形成的克隆不是来源于一个细胞，造成实验误差。

2、期望建立一种不需要复杂仪器，可以在实验室中广泛使用的pgcs单细胞克隆建系方法。由于流式细胞分选法需要专门的流式细胞仪和复杂的分选过程，可能会影响细胞存活率，而且也不利于在普通实验室的开展。另外，由于pgcs呈悬浮生长，如果在第一步中挑选的细胞多于1个，那么即使长出了克隆，也无法对克隆进行进一步筛选，更无法分辨这些细胞是否来源于单个细胞。因此有限稀释法也并不适用于鸡pgcs的单克隆细胞系建立。pgc直径相对较大，约15-20微米，并且可以在体式显微镜下清晰观察到。通过口吸管法挑选单个细胞进行培养具有一定的可行性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中的不足，提供一种鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，为pgcs介导的生物设计育种和模式动物生产提供新方法。

2、为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，包括以下步骤：

4、步骤1：准备制备挑选pgcs用口吸管的原材料，原材料包括：带有滤芯的移液器吸头、输液软管a、输液软管b、滤器、bj40玻璃管、封口膜；

5、步骤2：利用bj40玻璃管制备玻璃针管；

6、步骤3：制备挑选pgcs用口吸管：

7、输液软管a的一端连接滤器口径大的一端，并用封口膜在接口处密封固定，滤器口径小的一端连接输液软管b的一端，并用封口膜在接口处密封固定；将带有滤芯的移液器吸头与输液软管a的另一端连接；将步骤2制备得到的玻璃针管的钝端与输液软管b连接，并用封口膜密封固定；

8、步骤4：pgcs克隆单细胞系的建立：

9、用移液器转移pgcs到培养皿中，用facs培养基对pgcs进行稀释，使单个细胞在显微镜下分散开；随后，操作者口含口吸管一端的带有滤芯的移液器吸头，手持玻璃针管，从培养皿中挑选出单个pgcs，并转移到提前添加150μl facs培养液的96孔板中，在5％ co2、饱和湿度的37℃培养箱中进行培养；培养初期，每三天更换1/3的培养液，直到96孔板中细胞汇合度达到80-90％时，pgcs单克隆细胞系建立成功。操作过程中要注意挑选单个细胞进行培养，否则后期形成的克隆可能不是来源于一个细胞，又无法分清，造成实验的误差。另外，需要进一步限制培养条件以及换液方法，本发明中pgcs单克隆的培养条件和培养基也是针对于pgcs的，否则很难建立pgcs单克隆细胞系。

10、优选的，步骤2所述的利用bj40玻璃管制备玻璃针管，具体步骤如下：

11、双手持bj40玻璃管的两端，将bj40玻璃管中部放置在酒精灯外焰，前后旋转并左右移动bj40玻璃管，利用高温将bj40玻璃管中部烧软，随后使玻璃管离开火焰并迅速水平向两边拉开，使bj40玻璃管中间变细，将医用砂轮的一侧在火上烧过之后，用其将bj40玻璃管从中间截开，形成玻璃针管。

12、优选的，将玻璃针管的尖端在酒精灯蓝色火焰处轻轻灼烧，使玻璃针管尖端顺滑。

13、优选的，步骤3中输液软管a和输液软管b是通过一次性输液器制备得到，用剪刀剪下一次性输液器中间软管部分，一段为30-50厘米作为输液软管a，一段为10-20厘米作为输液软管b。

14、优选的，步骤3中所述带有滤芯的移液器吸头为带有滤芯的200μl移液器吸头。

15、优选的，步骤3中所述的滤器为0.22μm的滤器。

16、优选的，培养初期，每三天更换1/3的培养液，换液时将96孔板现在工作台中倾斜30°放置，静置5分钟，随后用100μl移液器从每个孔的表面一层轻轻吸液50μl并弃掉，进行下一个孔前更换吸头，完成所有孔的吸液后，每个孔加入37℃预热的facs培养液50-60μl，放入培养箱中继续培养。由于细胞呈悬浮生长，不能贴壁，所以换液时要小心，防止吸到底部的细胞，造成细胞损失；静置的目的是使细胞沉到底部，倾斜静置后，用移液器吸液时，从液体较厚的地方吸液，可以尽量减少吸到底部的细胞的可能性。

17、优选的，将步骤4中所述pgcs单克隆细胞系依次转移孔径逐渐放大的孔板中培养，或以1:4-1:2的比例进行传代培养。

18、优选的，所述facs培养基由禽ko-dmem基础培养基组成，并在培养基中添加1×b-27，2mm谷氨酰胺，1×mem非必需氨基酸溶液，0.1mmβ-巯基乙醇，1×核苷，1.2mm丙酮酸钠，0.2％鸡卵白蛋白，0.2％肝素钠，25ng/ml激活素a，4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，0.2％鸡血清；禽ko-dmem基础培养基包括250mosm/kg，12.0mm葡萄糖，0.15mm氯化钙。

19、本发明具有以下有益效果：(1)本发明可以进行正常pgcs和基因编辑pgcs的单克隆细胞系建立，且建系效率高，建系后的pgcs单克隆细胞系依然保持pgcs的生物学特性，为研究pgcs的生物学特性提供技术，也为基因编辑后模式动物的生产提供依据。

20、(2)本发明中挑选单个pgcs用口吸管和玻璃针的制备和组装操作方便、所用器材易获取，突破了昂贵仪器的限制；挑选单个pgcs的方法在显微镜下进行，每次能够很好的控制吸入细胞的数量，防止多个细胞一起生长造成的误差。本发明也可应用到其他细胞单克隆细胞系的建立过程中，为研究鸡pgcs生物学特性提供了一种新的途径，为家禽的良种扩繁、基因修饰及修饰后筛选、家禽分子设计育种和种质资源冷冻保存等提供了新的方法、奠定了实验基础；具有很好的推广应用价值。

技术特征：

1.一种鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，其特征在于，步骤2所述的利用bj40玻璃管制备玻璃针管，具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述的鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，其特征在于，将玻璃针管的尖端在酒精灯蓝色火焰处轻轻灼烧，使玻璃针管尖端顺滑。

4.根据权利要求1所述的鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，其特征在于，步骤3中输液软管a和输液软管b是通过一次性输液器制备得到，用剪刀剪下一次性输液器中间软管部分，一段为30-50厘米作为输液软管a，一段为10-20厘米作为输液软管b。

5.根据权利要求1所述的鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，其特征在于，步骤3中所述带有滤芯的移液器吸头为带有滤芯的200μl移液器吸头。

6.根据权利要求1所述的鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，其特征在于，步骤3中所述的滤器为0.22μm的滤器。

7.根据权利要求1所述的鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，其特征在于，培养初期，每三天更换1/3的培养液，换液时将96孔板现在工作台中倾斜30°放置，静置5分钟，随后用100μl移液器从每个孔的表面一层轻轻吸液50μl并弃掉，进行下一个孔前更换吸头，完成所有孔的吸液后，每个孔加入37℃预热的facs培养液50-60μl，放入培养箱中继续培养。

8.根据权利要求1所述的鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，其特征在于，将步骤4中所述pgcs单克隆细胞系依次转移至孔径逐渐放大的孔板中培养，或以1:4-1:2的比例进行传代培养。

9.根据权利要求1所说的的鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，其特征在于，所述facs培养基由禽ko-dmem基础培养基组成，并在培养基中添加1×b-27，2mm谷氨酰胺，1×mem非必需氨基酸溶液，0.1mmβ-巯基乙醇，1×核苷，1.2mm丙酮酸钠，0.2％鸡卵白蛋白，0.2％肝素钠，25ng/ml激活素a，4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，0.2％鸡血清；禽ko-dmem基础培养基包括250mosm/kg，12.0mm葡萄糖，0.15mm氯化钙。

技术总结
本发明涉及一种鸡原始生殖细胞单克隆细胞系建立的方法，属于畜牧学和生物技术领域；通过自制简易口吸管，用FAcs培养基对PGCs进行稀释，用口吸管分选单个PGCs，在5%CO<subgt;2</subgt;、饱和湿度的37℃培养箱中进行培养，每三天换一次培养液，建立PGCs的单克隆细胞系；本发明提供的方法可以在普通实验室高效稳定建立鸡PGCs单克隆细胞系，且不需要复杂昂贵的仪器，分选和建系效率高，为研究鸡PGCs生物学特性提供了一种新的途径，为家禽的良种扩繁、基因修饰及修饰后筛选、家禽分子设计育种和种质资源冷冻保存等提供了新的方法、奠定了实验基础。

技术研发人员：牛英杰,任文杰,郑丹,刘广政,李碧春,靳锴,左其生,张亚妮,陈国宏,孙红艳
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15