一种基于DNA探针的柃属花蜂蜜品质检测方法

本发明属于食品检测，涉及蜂蜜的品质检测，具体涉及一种基于dna探针的柃属花蜂蜜品质检测方法。

背景技术：

1、柃属花蜂蜜即市场上的柃蜜，俗称野桂花蜜，是由蜜蜂采集柃木花蜜酿制而成的。我国境内柃木的花期在每年10月下旬至次年3月，此时环境温度较低，一般只有中蜂才具备出巢采蜜的能力，导致柃蜜的产量较低，又因其味道香醇，在市场上深受消费者青睐，经济价值较高。

2、由于供需关系不平衡，导致市场上柃蜜掺假造假现象频发，造成市场混乱，消费者权益受损。常见的造假方式包括在柃蜜中混入其他种类的经济价值较低的蜂蜜，或经过高温浓缩加工的廉价蜂蜜。还有使用各种糖浆混合以模拟柃蜜风味，实际上并不包括柃蜜或柃蜜的含量较低。现有的蜂蜜品质检测方法包括感官分析法、蜂蜜孢粉学鉴定法和理化分析法。其中感官分析法、蜂蜜孢粉学鉴定法通过人工对蜂蜜或蜂蜜中的花粉进行观察，过于依赖过往的经验，识别结果不可靠。理化分析法通过实验测定蜂蜜中水、可溶性固形物、有机酸、果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖等物质的含量，判断蜂蜜类别。然而市场上蜂蜜的种类繁多、成分复杂、组分变化大，常规理化分析方法的实验成本较高、条件严格，消耗时间过长。

3、综上所述，针对目前市场上的蜂蜜造假行为，缺少一种迅速、有效、准确、可靠的柃属花蜂蜜品质检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提出了一种基于dna探针的柃属花蜂蜜品质检测方法，通过检测柃属花粉的dna含量，判断市售柃属花蜂蜜是否掺杂、造假，实现对柃属花蜂蜜的品质检测。

2、一种基于dna探针的柃属花蜂蜜品质检测方法，具体包括以下步骤：

3、步骤1、根据细枝柃的交配系统及遗传多样性设计用于荧光定量pcr扩增的引物探针序列，所述引物探针的上游序列为5’-aatctcgaggcttgtgcagt-3’，下游序列为5’-tgttaggccctgctatttgg-3’。

4、步骤2、提取待测柃属花蜂蜜中的花粉，采用ctab法提取花粉dna并测量浓度。若花粉dna的浓度高于设定阈值，进入步骤3，否则判定该待测蜂蜜为掺杂了浓缩加工蜜或糖浆的产品。

5、步骤3、设计荧光定量pcr反应体系，使用步骤1中设计的引物探针序列对步骤2中提取的花粉dna进行扩增。

6、步骤4、记录荧光定量pcr的结果，若未出现扩增曲线，说明提取的花粉中不含有柃属花粉，即待测蜂蜜为使用其他种类蜂蜜造假的产品。若出现扩增曲线，说明提取的花粉中含有柃属花粉成分，ct值越高说明柃属花粉的含量越高，即待测柃属花蜂蜜的品质越好。

7、本发明具有以下有益效果：

8、本发明通过从待测柃属花蜂蜜中提取花粉，测量其dna含量初步判断待测样本是否为浓缩加工蜜或糖浆造假，进一步通过特异性引物提取柃属dna片段并进行qpcr扩增，判断是否为柃蜜；相较于传统的pcr鉴定法对提取的dna进行电泳跑胶后，人工观察样本中是否含有目的基因的检测方法，通过qpcr法进行目的基因检测，能够直接得到目标dna的浓度、扩增状况、ct值，从检测结果中可以直接判断提取的dna中是否包含柃属花粉的dna及其含量，从而评价柃属花蜂蜜的品质。检测过程成本低廉、操作简单，检测后不会产生剧毒的凝胶，对环境友好。

技术特征：

1.一种基于dna探针的柃属花蜂蜜品质检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

2.如权利要求1所述一种基于dna探针的柃属花蜂蜜品质检测方法，其特征在于：步骤2中所述设定阈值为10ng/μl。

3.如权利要求1所述一种基于dna探针的柃属花蜂蜜品质检测方法，其特征在于：ctab法提取待测蜂蜜中的花粉dna的具体步骤为：

4.如权利要求1所述一种基于dna探针的柃属花蜂蜜品质检测方法，其特征在于：所述荧光定量pcr反应体系的总体积为10μl，其中taq dna聚合酶5μl，上、下游引物各0.3μl，ddh2o 3.4μl，dna 1μl。

5.如权利要求1或4所述一种基于dna探针的柃属花蜂蜜品质检测方法，其特征在于：扩增程序为：

技术总结
本发明公开了一种基于DNA探针的柃属花蜂蜜品质检测方法。该方法根据细枝柃的交配系统及遗传多样性设计了引物探针序列。使用CTAB法从待测蜂蜜中提取花粉DNA，并计算DNA浓度，根据浓度初步判断待测蜂蜜是否为浓缩加工蜜或糖浆。然后进一步使用设计的引物探针序列对提取到的花粉DNA进行荧光定量PCR扩增，记录式样过程中的荧光信号并计算CT值，根据实验结果判断待测蜂蜜中是否含有柃属花粉，从而完成对柃属花蜂蜜的品质检测。本方法能够特异、灵敏且准确地判定柃属蜂蜜样品中是否含有柃属植物源成分，对柃属蜂蜜的掺假造假起到一定作用。

技术研发人员：刘桐羽,王笑语,岳万福,刘梦斐
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16