基因BRCA2位点g.32332272G>A突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用的制作方法

本发明涉及于分子生物学，更具体的说是涉及基因brca2位点g.32332272g＞a突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用。

背景技术：

1、近年来我国癌症的发病率和死亡率不断攀升，恶性肿瘤已成为我国重大的公共卫生问题。据我国肿瘤登记中心2016年发布的结果显示，2012年我国肿瘤新发病例数358.6万例，死亡例数218.7万例，粗发病率265/10万，死亡率161.5/10万。在恶性肿瘤发病现状中，乳腺癌在女性恶性肿瘤中处于第一位，每年新发约27.3万，且发病年龄不断呈现年轻化趋势，是严重威胁女性生命的第一杀手。

2、乳腺癌是具有很强遗传背景的恶性肿瘤，现有研究显示5-10％的乳腺癌是由遗传因素导致。目前brca1、brca2、tp53、palb2、pten、chek2、atm以及rad等基因被认定为乳腺癌易感基因，其中brca1和brca2基因为遗传性乳腺癌的主要易感基因。研究表明，携带有brca1和brca2基因致病突变的人群在70岁之前发生乳腺癌的概率分别可达40-80％和20-85％，同时，已被诊断为遗传性乳腺癌的患者，发生复发转移的可能性也高于普通人群。

3、brca1和brca2属于抑癌基因，均呈常染色体显性遗传，且突变容易引发早年发病。brca2基因位于人类染色体13q12，包含27个外显子，编码brca2蛋白含3418个氨基酸，对细胞生长的调节有重要作用。brca2基因发生突变后表达的蛋白质失去了修复dna损伤的功能，导致染色体不稳定，促进肿瘤发生。男性brca2突变携带者终生患前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌的概率分别为20％、6％和3％，而女性brca2突变携带者终生患乳腺癌为26％-84％，卵巢癌的概率为20％。brca2基因突变相关的肿瘤往往会表达er(雌激素受体)与pr(孕激素受体)，与散发性乳腺癌表现出相似的特征。现已经报道的brca2突变主要是移码突变，也会发生大量的错义突变，但错义突变大多属于意义未明变异。因此，发现brca2新的致病突变，对开展遗传性乳腺癌的分子诊断具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了基因brca2位点g.32332272g＞a突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用，本发明提供了乳腺癌致病的新的突变位点，可对乳腺癌筛查辅助应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、基因brca2位点g.32332272g＞a突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用，其中，brca2基因序列如seq id no:1所示；突变型brca2基因序列如seq id no:2所示。

4、一种检测基因brca2位点g.39711928g＞a突变体的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示；

5、正向引物:5’-atgtgcttctgttttatactttaacaga-3’，如seq id no:3所示；

6、反向引物:5’-actttttgtagattttttgttctac-3’，如seq id no:4所示。

7、一种检测基因brca2位点g.32332272g＞a突变体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述引物。

8、一种基因brca2位点g.32332272g＞a突变体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

9、(1)提取待检样本中dna；

10、(2)以该dna为模板，利用上述引物进行pcr扩增反应，获得pcr扩增产物；

11、(3)检测brca2基因是否存在g.32332272g＞a突变基因；

12、作为本发明优选的技术方案，所述步骤(3)中，检测brca2位点g.32332272g＞a突变体的具体方法如下所示：

13、(1)利用琼脂糖凝胶将所述pcr扩增产物进行电泳；

14、(2)将电泳后的扩增产物进行纯化回收，以便于测序；

15、(3)纯化后的扩增产物在dna测序仪上进行测序，将测序结果与野生型brca2参考序列进行比对，确定是否有brca2位点g.32332272g＞a突变体。

16、作为本发明优选的技术方案，所述突变型brca2基因序列与野生型brca2基因序列具有g.39711928g＞a位点突变。

17、作为本发明优选的技术方案，所述brca2基因g.32332272g＞a位点突变是指突变位点在seq id no:1序列的第202位碱基g突变为a。

18、本发明的有益效果：本发明通过研究乳腺癌患者的基因序列，发现其brca2基因组第13号染色体的32332272位置发生碱基g到a碱基的突变，该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，数据库显示欧美人群该区域的扫描也未发现该突变位点。所以，本发明通过研究突变位点在乳腺癌辅助诊断的应用前景，阐述突变位点对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。

19、本发明的引物是通过针对人类brca2基因不同基因型的特异性序列位点的改变，所设计出针对突变位点的引物序列；利用该引物以及包含该引物的试剂盒可通过分离和研究乳腺癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血dna中的突变，寻找与乳腺癌相关的高特异性的突变位点，并研制出可临床或人群应用的乳腺癌辅助诊断试剂盒，为乳腺癌的筛查和诊断提供支持。

20、综上所述，本发明获得了乳腺癌发病相关突变位点谱和特异性标志物。通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。因此，本研究丰富了brca2基因的致病突变谱，对开展遗传性乳腺癌的分子诊断与高危人群筛查具有重要意义。

技术特征：

1.基因brca2位点g.32332272g>a突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用，其中，brca2基因序列如seq id no:1所示；突变型brca2基因序列如seq id no:2所示。

2.一种检测基因brca2位点g.32332272g>a突变体的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示；

3.一种检测基因brca2位点g.32332272g>a突变体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。

4.一种基因brca2位点g.32332272g>a突变体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种基因brca2位点g.32332272g>a突变体的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述检测brca2位点g.32332272g>a突变体的具体方法如下所示：

技术总结
本发明公开了基因BRCA2位点g.32332272G>A突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用以及检测基因BRCA2位点g.32332272G>A突变体的引物、试剂盒，该突变基因与BRCA2正常基因序列相比具有g.32332272G>A位点突变，所述BRCA2基因g.32332272G>A位点突变是指突变位点在SEQ ID NO:1序列的第202位碱基G突变为A。本发明获得了乳腺癌发病相关突变位点谱和特异性标志物。通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行。

技术研发人员：王学东,王玥苹,郑国沛,周道平,唐海林,顾娟
受保护的技术使用者：安徽省第二人民医院（安徽医学高等专科学校附属医院、安徽省职业病防治院）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15