一种HCVE2重组蛋白、抗HCVE2蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用与流程

本发明属于生物工程，具体涉及hcv e2重组蛋白、抗hcv e2蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用。

背景技术：

1、丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hcv)引起的肝脏疾病，是一种对全球健康威胁的疾病。

2、hcv具有高度的遗传异质性，目前分为11种基因型，每种基因型包含80种亚型；然而，一些疗法对某些基因型有效，但不是对所有的基因型都有效。开发一种安全有效的hcv疫苗仍然是全球控制hcv感染的重要目标。因此，对hcv感染的抗体介导的中和作用的深入了解可能成为疫苗设计的关键。实现有效免疫的主要挑战之一是hcv病毒的遗传多样性。可能需要产生许多中和抗体来克服这种变异性。据报道，hcv的e2糖蛋白可与细胞受体直接相互作用，并早已被认为是保护性免疫的重要免疫原性目标。

3、hcv诱导的细胞和体液免疫反应已被广泛研究。新的研究表明，单克隆抗体和多克隆抗体可以防止hcv感染。针对e2包膜糖蛋白的广义中和和被动转导的单克隆抗体可以预防hcv感染。因此，筛查hcv e2抗体可促进有效疫苗的开发。人血清e2特异性抗体、e1-e2免疫小鼠的多克隆igg和针对hcv包膜糖蛋白的单克隆抗体可以在体外中和hcvcc(培养的hcv细胞)。到目前为止，丙型肝炎疫苗的开发主要集中在t细胞免疫反应上。一些观察表明，e2n端高变异区1(hvr1)可能参与hcv中和，该区域含有细胞毒性t细胞表位和一些b细胞表位，而且该区域的抗体被证明可以阻止病毒结合。然而，hcv基因组的多样性严重阻碍了针对hcv感染的疫苗开发。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种hcv重组e2蛋白及其制备方法。

2、本发明的第二个目的在于提供基于hcv e2重组蛋白为抗原通过细胞融合得到的3株单克隆抗体及制备方法。

3、本发明的第三个目的在于提供了3株单克隆抗体识别的表位。

4、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

5、一种hcv e2重组蛋白，其氨基酸序列如seq id no1所示；编码其基因的核苷酸序列如seq id no2所示。

6、一种hcv e2重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

7、根据uniprot蛋白质数据库登录号o92972获取hcv e2蛋白氨基酸序列，按照hek293f密码子偏好性优化，设计3对引物合成至puc57质粒载体上，并引入酶切位点xhoⅰ/hindⅲ，在hcv e2蛋白的n端依次添加分泌信号肽和his标签，中间由linker连接，构建至pcaggs载体上，得到重组质粒pcaggs-e2；

8、将pcaggs-e2去内毒素质粒转染至密度为3×106cells/ml的hek293f细胞中，培养72h离心收集细胞上清，加入终浓度为1％的蛋白酶抑制剂，经0.45μm微孔滤膜过滤，再使用ni亲和层析纯化，得到纯化的重组hcv e2蛋白。

9、所述的3对引物为(seq id no:12-17)：

10、e2-f1 tcggacaccaccaccaccatcacggcggctctgagactcacactaccg

11、e2-f2 cttcctcctgctactctggctcccagataccaccggagagctcggacaccaccac

12、e2-f3 ccgctcgaggccaccatggaaaccccagcgcagcttctcttcctcctgctactc

13、e2-r1 tcgcggtcttccaggttgcaacgctcgccacgg

14、e2-r2 ctgcggtcgcggtcttccaggttgcaacgc

15、e2-r3 cccaagcttttactcgctgcggtcgcggtct。

16、纯化方法为：采用含20mm tris、150mm nacl、20-50mm咪唑的溶液洗去杂质，然后用200mm的咪唑洗脱目的蛋白，随后通过超滤管浓缩蛋白并除去咪唑。

17、所述的单克隆抗体为3株，编码3株单克隆抗体重链可变区的核酸序列如seq idno：3-5所示，轻链可变区的核酸序列如seq id no：6-8所示。

18、所述单克隆抗体的重链为包括igg1和igg2a型，轻链为kappa型。

19、3株单克隆抗体的特异性识别的表位分别为516vgttdrsgvptyswge531(seq id no:9)、527yswgenetdvmllnntr543(seq id no:10)和649gercnledrdrse661(seq id no:11)。

20、所述的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

21、选择6-8周龄的balb/c小鼠3只，将纯化后的重组hcv e2蛋白经弗氏完全佐剂乳化，用乳化后的蛋白按每只20μg的用量给小鼠皮下多点注射，3周后加强免疫，更换为弗氏不完全佐剂乳化后的蛋白，按每只20μg的用量注射，加强免疫2次后尾部采血，测定血清抗体效价，当抗体效价达到1万-5万时，则进行单克隆抗体的制备；

22、取小鼠脾脏，使用200目滤网使脾脏变成脾细胞单个悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0混合离心后，使用融合剂peg1500进行细胞融合，在hat选择培养基中培养7-10天，培养至小鼠骨髓瘤细胞sp2/0 3-5×106个；使用纯化的重组hcve2蛋白包被elisa板，吸取细胞上清作为一抗，羊抗鼠作为二抗，检测并筛选阳性杂交瘤细胞，随后利用有限稀释法进行亚克隆，进而筛选到3株单克隆抗体，分别为2f4-5f、3c8-10g、6e3-11b。

23、所述的单克隆抗体在hcv疫苗制备中的应用。

24、本发明的有益效果：

25、本发明利用hcv包膜糖蛋白e2在真核系统中以正确的空间折叠构象表达。通过细胞融合技术建立了小鼠单克隆细胞系，并通过western blot、免疫荧光检测确定抗体亚型等方法进行表征。最后，根据截短的蛋白片段与mabs的反应确定表位区域，为hcv疫苗的研制提供了理论基础。

26、本发明筛选得到的3株单克隆抗体3c8-10g、6e3-11b、2f4-5f，其效价分别为1:2.0×106、1:2.0×106和1:4.1×106，亲和力常数最高达4.6×108l/mol，3株单克隆抗体能识别3个不同的表位区域。序列比对发现，这3个表位在多个毒株中高度保守，故该3个表位是用于hcv诊断的潜在抗原靶点。

27、本发明建立的3株单克隆抗体具有高亲和力、强特异性等优点，识别的3个b细胞表位为首次报道，且位于e2蛋白的非高变区，在多个毒株序列中高度保守，该3个表位是hcv诊断试剂的潜在应用靶点。

28、本发明通过e2蛋白结构域免疫显性表位区域的确定，对hcv诊断和多肽疫苗的研发具有重要价值。

技术特征：

1.一种hcv e2重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no1所示。

2.根据权利要求1所述的hcv e2重组蛋白，其特征在于，编码其基因的核苷酸序列如seq id no2所示。

3.一种权利要求1所述的hcv e2重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的hcv e2重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述的3对引物为：

5.利用权利要求3所述的hcv e2重组蛋白的制备方法，其特征在于，纯化方法为：采用含20mm tris、150mm nacl、20-50mm咪唑的溶液洗去杂质，然后用200mm的咪唑洗脱目的蛋白，随后通过超滤管浓缩蛋白并除去咪唑。

6.一种基于权利要求1所述的hcv e2重组蛋白制备的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体为3株，编码3株单克隆抗体重链可变区的核酸序列如seq id no：3-5所示，轻链可变区的核酸序列如seq id no：6-8所示。

7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链为包括igg1和igg2a型，轻链为kappa型。

8.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，3株单克隆抗体的特异性识别的表位分别为516vgttdrsgvptyswge531、527yswgenetdvmllnntr543和649gercnledrdrse661。

9.一种权利要求6所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

10.一种权利要求6-8所述的单克隆抗体在hcv疫苗制备中的应用。

技术总结
本发明涉及一种HCV E2重组蛋白、抗HCV E2蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用。本发明利用HCV包膜糖蛋白E2在真核系统中以正确的空间折叠构象表达。通过细胞融合技术建立了小鼠单克隆细胞系，并通过Western blot、免疫荧光检测确定抗体亚型等方法进行表征。最后，根据截短的蛋白片段与mAbs的反应确定表位区域。本发明建立的3株单克隆抗体具有高亲和力、强特异性等优点，识别的3个B细胞表位为首次报道，位于E2蛋白的非高变区，在多个毒株序列中高度保守，这3个表位是HCV诊断试剂的潜在应用靶点。本发明通过E2蛋白结构域免疫显性表位区域的确定，对HCV诊断和多肽疫苗的研发具有重要价值。

技术研发人员：张改平,王爱萍,周景明,陈玉梅,刘红亮,丁培阳,梁超,朱习芳,刘恩平
受保护的技术使用者：龙湖现代免疫实验室
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15