巨大芽孢杆菌LY114及其在奶酪制作中的应用

本发明属于生物，具体涉及巨大芽孢杆菌ly114及其在奶酪制作中的应用。

背景技术：

1、凝乳酶是奶酪制作和乳品加工中的关键酶制剂。凝乳酶可以使奶液凝固并影响奶酪的产量、质地、风味等。传统凝乳酶主要来源于动物，如小牛、羔羊、骆驼等。最常用的传统凝乳酶是小牛皱胃酶，它可以从哺乳小牛的第四个皱胃中获取。然而传统凝乳酶具有生长周期长、生产成本高等劣势，寻找传统凝乳酶优质替代物引起了人们极大的兴趣。国内目前对凝乳酶的研究相对滞后，凝乳酶的供应主要依靠国外生产，国内仅有一些科研机构对其进行了较为系统的研究。我国的原制干酪生产工业尚未形成规模化生产，在国内的乳制品消费中占有较少的比重，因而对其生产与加工的研究相对较少。随着国内奶酪市场的不断扩大，以及国内食品加工业的发展，世界范围内的凝乳酶需求量将会进一步加大。因此，提高凝乳酶的产率，提高其产品品质，是推动我国奶业发展的重要因素。

2、与植物源和动物源的凝乳酶相比，微生物来源的凝乳酶生产成本低，提取容易，经济效益高，生化多样性更广，可以很好地解决小牛皱胃酶供应不足的问题。目前，对细菌源凝乳酶的研究还不多，有关的研究多以枯草芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌为研究对象，且存凝乳活力低、蛋白水解活性高等问题，已成为影响其研究开发及开发利用的瓶颈。与真菌的固态发酵相比，细菌的浸入式发酵在控制发酵程度和物质利用率方面具有明显优势，同时，通过对新菌种进行筛选，优化其发酵工艺，可以有效地解决细菌源凝乳酶的mca/pa比值较低的问题。因此，关于细菌凝乳酶的研究也越来越多。

3、从优质原料中筛选出高产凝乳酶的细菌菌株，确定最佳发酵工艺，并对此菌源凝乳酶的凝乳特性进行分析，以确定其凝乳特性能否达到后期干酪生产的要求，对丰富产凝乳酶菌株库及扩大其开发生产具有重要意义。从天然原料中分离得到的凝乳酶活力不高，发酵周期长，在纯化过程中酶活有较大损失，其特性不能很好满足干酪生产的需要。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种巨大芽孢杆菌ly114及其在奶酪制作中应用的技术方案。该巨大芽孢杆菌ly114及其在奶酪制作中的应用具有高凝乳活性、发酵时间短、纯化比高等特性，可用于制备优良性质的凝乳酶以满足干酪生产需要。

2、本发明具体采用以下技术方案实现：

3、本发明第一方面提供了一株巨大芽孢杆菌ly114，分类命名为bacillusmegaterium。该菌株已于2023年03月03日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为：cgmcc no.26730。

4、该菌株分离筛选于山东省莱阳市奶牛场挤奶区土壤。

5、该菌株筛选方法如下：根据宁夏、云南、黑龙江、山东等地奶牛场中所筛选得到的90余株菌中通过分析各菌株在酪蛋白平板上形成的沉淀圈和水解圈情况，确定具有产凝乳酶能力的菌株。进一步分析具有产凝乳酶能力的菌株单菌落在酪蛋白平板上不同时间点菌落直径、沉淀圈与水解圈直径的比值情况，挑选比值较大的菌株。对挑选的若干菌株进行发酵培养，测定分析不同发酵时间蛋白酶水解活力，所产凝乳酶的凝乳活力、蛋白水解活力及凝乳后的脱脂乳ph值，综合对比，确定菌株。

6、本发明第二方面提供了巨大芽孢杆菌ly114在制备凝乳酶中的应用。

7、本发明第三方面提供了利用巨大芽孢杆菌ly114制备凝乳酶的方法，其包括以下步骤：

8、1)将巨大芽孢杆菌ly114涂布、划线培养12h，然后接种于改良tyc培养基中37℃，180r/min震荡培养10～12h得到种子液；

9、2)将上述种子液以5％体积比接种量接种于麸皮培养基中于37℃，180r/min震荡培养36～48h得发酵液，将所得到的发酵液低温离心取上清液；

10、3)将硫酸铵与步骤2)中所得的上清液混合，于4℃下沉淀2h，低温高速离心弃上清，收集沉淀，复溶于20mmol/l ph 7.0的tris-hcl缓冲液中，于4℃下搅拌透析12h，经冷冻干燥后得粗制凝乳酶粉末；

11、4)将粗酶溶于20mmol/l ph 7.0的tris-hcl缓冲液，通过0.22μm滤膜，经deae-sepharose fast flow阴离子交换层析分离纯化并透析、冻干后得到凝乳酶产品。

12、进一步，所述步骤1)中改良tyc培养基为：葡萄糖50g，酪蛋白胨15g，氯化钠1g，碳酸氢钠2g，l-胱氨酸0.2g，磷酸氢二钠2g，酵母膏5g，去离子水定容至1000ml，115℃灭菌20min；所述步骤2)中麸皮培养基为：去离子水1000ml，熟小麦细麸皮20～60g，115℃灭菌20min。

13、进一步，所述步骤3)中硫酸铵与上清液混合后形成的混合液中硫酸铵饱和度为60％。

14、进一步，所述步骤3)中冷冻干燥以及步骤4)中冻干参数为：-80℃预冻300min；-80℃冻干800min。

15、进一步，所述步骤4)中deae-sepharose fast flow阴离子交换柱，体积为5ml，起始洗脱条件为20mmol/l ph 8.0的tris-hcl缓冲液，流速为0.5ml/min。

16、进一步，所述步骤4)中透析条件为：4℃下搅拌透析12h。

17、本发明第四方面提供了一种通过上述任一方法制备得到的凝乳酶。

18、本发明所述凝乳酶活性指：40min凝集l ml 10％脱脂奶粉的酶量义为—个活力单位su(soxhlet unit)。

19、凝乳活力(su)＝(供试乳数量/凝乳酶量)×2400/t×n，式中：2400为40min转化为秒为单位；n为稀释倍数；t为凝乳时间，s。

20、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

21、本发明所用试剂和原料均市售可得。

22、本发明的有益效果在于：本发明筛选的巨大芽孢杆菌ly114经10～12h震荡培养后发酵48h即可达到最大凝乳活性，可达440su/ml以上，经纯化后比酶活为7532su/mg，得率为34.17％，提纯比达4.83。此外，在底物浓度ph较低时凝乳活力低，从而使得凝乳酶在奶酪生产后期更易排出。

23、因此，本发明筛选的巨大芽孢杆菌ly114所产的凝乳酶活性较高，经纯化后，其比酶活、得率和提纯比较高，可以提升凝乳酶的纯化效率，并且大幅度缩短了发酵周期，加快了生产速度，成本低廉，其特性也能更好地满足后期干酪规模化的生产需要，为进一步实现细菌源凝乳酶的工业化生产提供了重要依据。

技术特征：

1.巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)ly114，其保藏编号为cgmccno.26730。

2.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌ly114在制备凝乳酶中的应用。

3.利用权利要求1所述的巨大芽孢杆菌ly114制备凝乳酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤1)中改良tyc培养基为：葡萄糖50g，酪蛋白胨15g，氯化钠1g，碳酸氢钠2g，l-胱氨酸0.2g，磷酸氢二钠2g，酵母膏5g，去离子水定容至1000ml，115℃灭菌20min；所述步骤2)中发酵培养基为：去离子水1000ml，熟小麦细麸皮20～60g，可溶性淀粉10g，玉米浆3g，115℃灭菌20min。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤3)中硫酸铵与上清液混合后形成的混合液中硫酸铵饱和度为60％。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤3)中冷冻干燥以及步骤4)中冻干参数为：-80℃预冻300min；-80℃冻干800min。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤4)中deae-sepharose fast flow阴离子交换柱，体积为5ml，起始洗脱条件为20mmol/l ph 8.0的tris-hcl缓冲液，流速为0.5ml/min。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤4)中透析条件为：4℃下搅拌透析12h。

9.一种如权利要求3～8任意一项所述方法制备得到的凝乳酶。

技术总结
巨大芽孢杆菌LY114及其应用，属于生物技术领域。本发明一方面提供了一株新的巨大芽孢杆菌LY114，另一方面提供了该巨大芽孢杆菌LY114的应用。发明筛选的巨大芽孢杆菌所产的凝乳酶活性较高，经纯化后，其比酶活、得率和提纯比较高，可以提升凝乳酶的纯化效率，并且大幅度缩短了发酵周期，加快了生产速度，成本低廉，其特性也能更好地满足后期干酪规模化的生产需要，为进一步实现细菌源凝乳酶的工业化生产提供了重要依据。

技术研发人员：张尧,吴元锋,王佳欣,刘晓凤,何佳敏,孙娟,宋新杰
受保护的技术使用者：浙江科技学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16