一种四环素类抗生素广谱适配体

本发明涉及一种四环素类抗生素广谱适配体，属于分子生物学领域。

背景技术：

1、四环素类抗生素在奶牛养殖场中的的大量使用导致牛奶中存在兽药残留，这些残留物最终会通过食物链在人体内积累，并进一步引发一系列不良影响，比如影响牙齿发育、损害肝脏和肾脏、降低人体免疫力。因此，建立一种同时快速检测牛奶中4种四环素类抗生素残留的检测方法是保障乳品行业安全和人类健康的重要途经。

2、目前，牛奶中四环素类抗生素残留的检测方法主要分为两大类：一类是以质谱和液相色谱为主的仪器检测，操作复杂、仪器昂贵、需专门的技术人员进行操作；另一类是快速检测方法，仅检测单种抗生素或者几种抗生素，已经不能满足日益增多的大量样本快速、高效检测的要求。因此，迫切需要开发新的传感策略，为食品安全领域提供简单、高灵敏度和方便准确的四环素类抗生素残留同步检测方法。

3、 适配体是通过指数富集配体系统进化技术（selex）从人工构建的随机寡核苷酸文库中筛选和扩增获得的单链短dna或rna序列，通常由20-80个碱基组成，库中寡核苷酸序列数可达 1013-1016个。适配体包含四个相似的亚基，通过链内某些互补碱基配对、静电作用等发生自身适应性折叠，形成复杂的二级、三级结构，为靶标提供核心结合区域，因此可与小分子、微生物、蛋白质等多种靶标相结合，且经多次筛选获得的核酸适配体与靶分子有很高的特异性和亲和力。综上，基于适配体的传感分析方法已成为抗生素残留检测的重要手段。

4、广谱性适配体的特性决定着分析检测的灵敏度和广谱特异性，是目前制约抗生素多残留分析技术发展的主要瓶颈。而目前有关抗生素广谱适配体筛选的研究报道有限，一定程度上制约了基于广谱适配体识别的抗生素多残留分析技术的发展。因此，有必要筛选出高特异性和亲和力的四环素类抗生素广谱适配体，利用适配体探针来增强化学稳定性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决上述问题，以四环素、土霉素、金霉素和强力霉素为混合靶标，采用氧化石墨烯（go）-selex进行四环素类抗生素广谱适配体的筛选，以获得四环素类抗生素广谱适配体，实现四环素类抗生素同步快速检测。

2、为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案：一种四环素类抗生素广谱适配体，包括以下步骤。

3、（1）通过筛选获得四环素类抗生素广谱适配体，其序列为tcgtcgacggatccatggcacatggattactagcgaacgcatgagccggctgcggcgcatgcgt。

4、（2）四环素类抗生素广谱适配体序列分析。

5、（3）四环素类抗生素广谱适配体亲和力分析和特异性验证。

6、（4）四环素类抗生素广谱适配体截短优化。

7、 优选的是，步骤（1）中四环素类抗生素广谱适配体的筛选，所采用的随机文库为79 nt的单链寡核苷酸，由生物公司合成，包括上、下游引物和中间35个随机核苷酸序列。

8、 优选的是，步骤（1）四环素类抗生素广谱适配体正筛选以含有并四苯基本骨架的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素作为混合靶标，与初始文库孵育后加入氧化石墨烯，经离心纯化pcr扩增后进行凝胶电泳验证，接着制备单链，重复以上筛选过程，随着筛选进行，与靶标亲和力高的ssdna不断得到富集。 优选的是，步骤（1）四环素类抗生素广谱适配体反筛选，以四环素类抗生以外的抗生素如青霉素、氨苄青霉素三水、羟氨苄青霉素、苯唑西林钠作为反筛靶标，与上一轮产物混合孵育，加入氧化石墨烯吸附未与反筛靶标结合的单链寡核苷酸，离心去除能与反筛靶标结合的适配体，以提高所筛选适配体的特异性。

9、 优选的是，步骤（1）筛选第一轮，将1 μl dna 初始文库 (100 μm)加入到199μl结合缓冲液中，与混合靶标孵育后，加入500 μl 氧化石墨烯溶液 (2 mg/ml)，以吸附未与靶标结合的ssdna序列，混合2 h后，通过离心去除氧化石墨烯。

10、 优选的是，步骤（1）pcr下游引物用生物素标记，pcr产物用提取试剂盒去除酶和引物。随后用3%琼脂糖凝胶进行电泳验证，其中dna染料gelred与纯化的pcr产物在loadingbuffer中混合。对生成的dna条带进行成像和观察，以评估selex的效率。

11、 优选的是，步骤（1）制备核苷酸单链，pcr产物与链霉亲和素修饰的磁珠混合孵育，dna 通过生物素与链霉亲和素的作用连接在链霉亲和素磁珠上，通过naoh溶液解离dna双链，收集洗脱液作为下一轮的次级文库。

12、优选的是，步骤（1）最后一轮筛选pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳验证，对pcr产物纯化回收，并与pmd-19t载体连接，通过热激转化转移到大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性的菌落培养后提取质粒进行测序，获得适配体序列。

13、优选的是，步骤（2）通过m-fold分析适配体二级结构，结合利用dnaman8分析的一级结构的同源性和二级结构的相似性，以及自由能等因素，获得5条候选序列。

14、 优选的是，步骤（3）利用荧光法，通过荧光分光光度计测量最大荧光值，用origin8.0软件进行非线性拟合，测定筛选序列的解离常数以表征获得的适配体核酸序列亲和力和特异性。

15、优选的是，步骤（4）采用分子对接模拟研究亲和力最高的适配体与四环素类抗生素的主要结合位点，适配体能够形成结合口袋，在氢键作用下，与四环素类抗生素稳定结合，其保守序列ttcaagcg是四环素类抗生素广谱适配体识别的关键区域。依据此结果，结合适配体二级结构分析，对此适配体序列进行截短优化。

16、优选的是，步骤（4）在保留发夹和环的基础上去除掉两端不参与结合口袋形成的多余碱基，采用三种截短方法对四环素类抗生素广谱适配体进行截短优化，获得亲和力和特异性更高的适配体序列tcgtcgacggatccatggcacatggattactagcgaacgcatgagccggctgcggcgcatgcgt。利用荧光法验证该序列的亲和力和特异性。

17、本发明具有以下有益效果。

18、本发明采用go-selex，以含有并四苯基本骨架的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素作为混合靶标，筛选获得了一种四环素类抗生素广谱适配体，此广谱适配体具有良好的亲和力和特异性，以筛选的适配体为识别元件构建生物传感器，可实现四环素类抗生素同步检测，为监管部门的现场快速灵敏监测提供重要基础。

技术特征：

1.一种四环素类抗生素广谱适配体，其特征在于，包括如下步骤：

2. 根据权利要求1所述的一种四环素类抗生素广谱适配体，其特征在于，步骤（1）所述四环素类抗生素广谱适配体的筛选，初始ssdna文库含有79 nt 单链寡核苷酸，包括上、下游引物和中间35个随机核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种四环素类抗生素广谱适配体，其特征在于，步骤（1）四环素类抗生素广谱适配体正筛选以含有并四苯基本骨架的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素作为混合靶标，与初始文库孵育后加入氧化石墨烯，经离心纯化pcr扩增后进行凝胶电泳验证，接着制备单链，重复以上筛选过程，随着筛选进行，与靶标亲和力高的ssdna不断得到富集。

4.根据权利要求1所述的一种四环素类抗生素广谱适配体，其特征在于，步骤（1）四环素类抗生素广谱适配体反筛选以四环素类抗生以外的抗生素如青霉素、氨苄青霉素三水、羟氨苄青霉素、苯唑西林钠作为反筛靶标，与上一轮产物混合孵育，去除能与反筛靶标结合的适配体，以提高所筛选适配体的特异性。

5.根据权利要求3和4所述的一种四环素类抗生素广谱适配体，其特征在于，利用荧光法对筛选得到的适配体进行亲和力分析和特异性验证。

6.根据权利要求5所述的一种四环素类抗生素广谱适配体，其特征在于，基于分子对接模拟结果，判断适配体与四环素类抗生素的主要结合位点，发现其保守序列ttcaagcg是四环素类抗生素广谱适配体识别的关键区域，适配体能够形成结合口袋，在氢键作用下，与四环素类抗生素稳定结合。

7.根据权利要求6所述的四环素类抗生素广谱适配体，其特征在于，依据分子对接模拟结果，结合适配体二级结构分析，对适配体序列进行截短优化，去除两端不参与结合口袋形成的多余碱基，获得亲和力和特异性更高的适配体序列tcgtcgacggatccatggcacatggattactagcgaacgcatgagccggctgcggcgcatgcgt。

8.根据权利要求7所述的四环素类抗生素广谱适配体，其特征在于，步骤（4）获得的适配体，采用通过荧光法测定获得的适配体亲和性和特异性。

技术总结
本发明公开了一种四环素类抗生素广谱适配体，属于分子生物学领域。本发明以四环素、土霉素、金霉素和强力霉素为混合靶标，采用基于氧化石墨烯的指数富集配体系统进化技术技术（GO‑SELEX）筛选获得了四环素类抗生素广谱适配体，并用荧光法验证了其高亲和力和高特异性，之后通过分子对接模拟进行序列分析和截短优化，明确了保守序列TTCAAGCG是四环素类抗生素广谱适配体的关键识别区域，获得了比原始适体具有更高亲和力和特异性的适体，解离常数为4.27~7.20 nM。该优化适配体为四环素类抗生素同步检测提供新的识别元件，具有广泛的应用前景。

技术研发人员：孙霞,白梦圆,郭业民,岳凤玲,翟晟西,胡孟娇
受保护的技术使用者：山东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15