烟草耐低温基因NtZFP66L1及其应用的制作方法

本发明涉及烟草耐低温基因筛选，更具体的说是涉及烟草耐低温基因ntzfp66l1及其应用。

背景技术：

1、烟草(nicotiana tabacum l.)起源于温暖的南美洲，是一种喜温不耐冷的叶用经济作物，其最适生长温度为25℃～28℃，烟草对低温胁迫敏感，-2℃～3℃的低温胁迫就会导致烟草的死亡。烟草苗期对低温胁迫更为明显，在6～7叶龄时，如果烟草遭受到两周左右的12℃低温胁迫就会导致烟草提早开花，降低烟叶产量与品质，从而减少烟农收入。

2、在中国南方烟区，烟草移栽之后经常会遭受“倒春寒”的天气，使烟草遭受低温胁迫。目前主要是通过适时移栽等方法来应对“倒春寒”，这种方式虽然可以在一定程度上减少低温造成的损失，但是要从根本上解决这个问题还是需要结合分子生物技术手段挖掘烟草耐低温基因，选育更为耐低温的烟草品种。

3、锌指蛋白(zinc fingerprotein)，一类能够结合zn2+的“手指”状dna结合蛋白。该蛋白以锌指基序为特征，通常作为一种重要的转录因子发挥功能，通过与目的基因启动子序列相结合的方式调控基因表达。依据锌指结构域中半胱氨酸(c)以及组氨酸(h)数目以及排列方式将锌指蛋白分为9个亚家族：c2h2、c2hc、c2hc5、c3h、c3hc4、c4、c4hc3、c6、c8。ccch型锌指蛋白是锌指蛋白家族中很小的一类，其是指包含有ccch型锌指基序的一类蛋白质。典型的ccch型锌指蛋白至少含有一个或者更多的由3个半胱氨酸和1个组氨酸残基顺序排列组成的锌指基序，这种锌指基序最早被定义为c-x6-14-c-x4-5-c-x3-h(x为任意氨基酸)。近来的研究发现，与其他类型的锌指蛋白不同，ccch锌指蛋白不仅能与dna和蛋白质互作，也能与rna结合。

4、c3h型锌指蛋白在植物整个生长发育过程中发挥了重要作用，同时还是植物激素响应和逆境响应的重要调节因子。虽然目前已经发现了不少ccch型锌指蛋白基因，但是仅有很少一部分的基因功能被揭示。研究发现，拟南芥attzf5，attzf6/pei1和attzf4/somnus参与光和激素介导调控的种子萌发过程，调控种子萌发和胚发育。atc3h14和atc3h15基因调控次生壁增厚、影响花粉粒的形成，参与了拟南芥花粉粒和花药壁的发育过程。超表达含3个ccch锌指基序的atc3h17基因使得拟南芥早花，而其突变体材料可延迟开花，这说明atc3h17在拟南芥成花诱导进程中发挥作用。水稻ostzf1起到延缓叶片衰老的作用，杨树pdc3h17在次生壁的形成过程中发挥作用。在激素应答方面，atzf1，atzf4，atzf5，atzf6参与调控aba和ga的响应，atc3h49/atc3h20、atozf1/atozf2和attzf2/attzf3参与aba和ja的响应。ccch型锌指蛋白在植物抗逆方面也发挥着积极作用，在拟南芥中过表达attzf2和attzf3显著增强了植株的耐旱性、耐盐性以及抗氧化能力，atszf1和atszf2提高了拟南芥的盐胁迫耐受力。

5、因此，如何提供一种新的含锌指基序的烟草耐低温基因是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种烟草耐低温基因ntzfp66l1及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种烟草耐低温基因ntzfp66l1，所述基因ntzfp66l1的cds编码序列如seq idno.9所示。

4、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种基因ntzfp66l1的cds编码序列编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示。

5、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的基因ntzfp66l1在提高烟草耐低温性能中的应用。

6、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的基因ntzfp66l1在筛选耐低温烟草材料中的应用。

7、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明本研究基于前期多组学联合分析，从中挖掘到一个受低温显著诱导的基因，研究发现该基因cds序列长度为2076bp，编码691个氨基酸，编码一个ccch锌指结构蛋白类似蛋白(nicotiana tabacum zinc fingerccch domain-containing protein 66-like)，因此将其命名为ntzfp66l1。系统进化树和蛋白序列同源比对结果发现，ntzfp66l1与绒毛烟草ntozfp66l、林烟草nszfp66l-x1/x2及渐狭叶野生烟草nazfp66l、nazfp66亲缘关系较近、同源性较高。以湘烟7号为背景，利用crispr技术获得了该基因的敲除株系zfp66l1-15和zfp66l1-16。表型鉴定结果表明，低温胁迫下与湘烟7号(wt)相比，两个敲除株系萎蔫程度更严重，其叶片中mda、h2o2含量明显升高，可溶性蛋白(sp)、脯氨酸(pro)和谷胱甘肽(gsh)含量显著降低。该结果表明，敲除ntzfp66l1基因导致烟草低温耐受性降低，也证明了该基因正调控烟草耐冷性。该基因的挖掘与功能鉴定，为烟草耐低温育种提供了重要的基因资源和理论基础。

技术特征：

1.一种烟草耐低温基因ntzfp66l1，其特征在于，所述基因ntzfp66l1的cds编码序列如seq id no.9所示。

2.一种基因ntzfp66l1的cds编码序列编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示。

3.权利要求1所述的基因ntzfp66l1在提高烟草耐低温性能中的应用。

4.权利要求1所述的基因ntzfp66l1在筛选耐低温烟草材料中的应用。

技术总结
本发明公开了一种烟草耐低温基因NtZFP66L1，所述基因NtZFP66L1的CDS编码序列如SEQ ID NO.9所示，编码的蛋白SEQ ID NO.10所示，同时，以湘烟7号为背景，利用CRISPR技术获得了该基因的敲除株系zfp66l1‑15和zfp66l1‑16。表型鉴定结果表明，低温胁迫下与湘烟7号(WT)相比，两个敲除株系萎蔫程度更严重，其叶片中MDA、H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;含量明显升高，可溶性蛋白(SP)、脯氨酸(PRO)和谷胱甘肽(GSH)含量显著降低。该结果表明，敲除NtZFP66L1基因导致烟草低温耐受性降低，也证明了该基因正调控烟草耐冷性。

技术研发人员：胡日生,户正荣,任晓敏,李洋洋,姜习振,晏伟杰,向世鹏,杨佳蒴,易鹏飞,杨晨凯
受保护的技术使用者：中国烟草总公司湖南省公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15