一种分离鉴定百合木贼镰刀菌的方法

本发明属于生物，具体涉及一种分离鉴定百合木贼镰刀菌的方法。

背景技术：

1、百合是百合科(liliacea)百合属(lilium)多年生球根花卉，是世界五大切花之一，也是高档盆花和优良的庭院栽培花卉。由于百合较易感病，随着栽培面积的扩大以及栽培时间的延长，百合病害发生日益严重。在百合病害中，以镰刀菌为主要病原引起的百合枯萎病是百合生产中危害最严重的病害之一。目前已鉴定的百合枯萎病病原菌主要有尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(fusarium solani)、三线镰刀菌(fusariumtricinctum)、烟草镰刀菌(fusarium tabacinum)、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)、层出镰刀菌(fusarium proliferatum)、共享镰刀菌(fusarium commune)和藤黄镰刀菌(fusarium fujikuroi)。植株被镰刀菌侵染后，地下鳞茎腐烂，地上植株叶片萎蔫干枯，茎基部缢缩，大批植株于开花前提早枯死，严重影响百合的产量和品质。因此，分离并准确、快速地鉴定百合枯萎病病原菌对有效防止病害蔓延具有重要意义。

2、目前，镰刀菌的鉴定方法主要有传统的形态学鉴定和分子生物学鉴定两种。传统的形态学鉴定方法耗时费事，分子生物学鉴定大大提高了鉴定的准确性和效率，因而在镰刀菌的鉴定上得到广泛应用。镰刀菌分子鉴定通常依据镰刀菌基因组的核苷酸序列进行序列分析，目前常用的方法是根据18s rdna及28srdna间的内转录间隔区(internaltranscribed space，its)序列分析进行镰刀菌不同种属的分类鉴定。然而，通用引物的its序列分类鉴定只能区分至镰刀菌属，无法直接区分镰刀属的不同种，必须借助于详细的序列对比，分析被试菌种与基因序列库中已知菌种的同源性，使分子鉴定更为繁琐。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种分离鉴定百合木贼镰刀菌的方法。

2、为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

3、提供一种分离鉴定百合木贼镰刀菌的方法，包括以下步骤：

4、s1、分离纯化病原菌：取百合发病鳞片，流水冲洗干净后进行表面灭菌，切取病健交界处组织于pda固体培养基上培养，待菌落出现后，挑取菌落边缘菌丝转接于pda平板上进行纯化培养；

5、s2、设计特异性引物：获取尖孢镰刀菌百合专化型、共享镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、层出镰刀菌的基因组，将木贼镰刀菌基因组与其他镰刀菌基因组两两比较，通过贪婪算法将两个基因组中能够匹配的序列延伸，不能匹配的片段即为木贼镰刀菌基因组的特异序列；将特异序列在ncbi网站比对，选择没有比对数据及比对数据较少的序列进行引物设计；

6、将木贼镰刀菌的特异性引物对命名为fe-lilii f/fe-lilii r，正向引物fe-lilii f的碱基序列为5＇－cgaagaagcctctcggaccat－3＇，反向引物fe-lilii r的碱基序列为5＇－cgtagccagccatgatgatgtg－3＇；

7、s3、pcr鉴定病原菌：用特异引物fe-lilii f/fe-lilii r对分离纯化得到的病原菌进行pcr扩增，若病原菌能通过特异引物fe-lilii f/fe-lilii r进行扩增，则确定其为木贼镰刀菌。

8、进一步地，步骤s1中，灭菌方法为：70％酒精30s，0.2％naclo 5min，无菌水冲洗4-6次。

9、进一步地，步骤s1中，纯化培养条件：25℃，暗培养。

10、进一步地，步骤s3中，pcr扩增体系为20μl：模板dna 1μl，引物fe-lilii f，10μm，0.5μl，引物fe-lilii r，10μm，0.5μl，2×taq pcr master mix 10μl，ddh2o 8μl；pcr扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，共26个循环；72℃延伸10min。

11、本发明的有益效果为：

12、1.本发明从百合上分离出了新的镰刀属致病菌，鉴定为百合木贼镰刀菌。

13、2.本发明百合木贼镰刀菌特异性引物的设计基于基因组，非its区。

技术特征：

1.一种分离鉴定百合木贼镰刀菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的分离鉴定百合木贼镰刀菌的方法，其特征在于，步骤s1中，灭菌方法为：70％酒精30s，0.2％naclo 5min，无菌水冲洗4-6次。

3.根据权利要求1所述的分离鉴定百合木贼镰刀菌的方法，其特征在于，步骤s1中，纯化培养条件：25℃，暗培养。

4.根据权利要求1所述的分离鉴定百合木贼镰刀菌的方法，其特征在于，步骤s3中，pcr扩增体系为20μl：模板dna 1μl，引物fe-lilii f，10μm，0.5μl，引物fe-lilii r，10μm，0.5μl，2×taq pcr master mix 10μl，ddh2o 8μl；pcr扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，共26个循环；72℃延伸10min。

技术总结
本发明公开了一种分离鉴定百合木贼镰刀菌的方法，包括以下步骤：分离纯化病原菌，设计特异性引物：获取尖孢镰刀菌百合专化型、共享镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、层出镰刀菌的基因组，将木贼镰刀菌基因组与其他四种镰刀菌基因组两两比较，通过贪婪算法将两个基因组中能够匹配的序列延伸，不能匹配的片段即为木贼镰刀菌基因组的特异序列；将序列在NCBI网站比对，选择没有比对数据及比对数据较少的序列进行引物设计；PCR鉴定病原菌。本发明从百合上分离出了新的镰刀属致病菌，鉴定为百合木贼镰刀菌，该百合木贼镰刀菌特异性引物的设计基于基因组，非ITS区。

技术研发人员：明军,杨盼盼,徐雷锋
受保护的技术使用者：中国农业科学院蔬菜花卉研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15