抗CD146跨膜受体的纳米单域抗体及其应用

本发明涉及生物，尤其涉及一类抗cd146跨膜受体的纳米单域抗体。

背景技术：

1、cd146是在人黑色素瘤细胞膜上发现的一种113kda的糖蛋白，又称为黑色素瘤细胞黏附分子(mcam)。cd146作为一种跨膜受体具有较大的胞外配体结合区和较短的胞内区，cd146在许多肿瘤和内皮细胞中高度表达，近些年的研究发现cd146在肿瘤血管生成、促进转移迁移进程和化放疗耐药中发挥着重要的作用。cd146作为细胞粘附分子，表达的上调增强了cd146与其配体之间的相互作用，改变细胞-细胞和细胞-基质粘附之间的平衡，同时促转移细胞因子的分泌增加导致细胞通过血管或淋巴循环扩散，并外渗至远处器官导致肿瘤的转移。此外cd146作为共同受体可以增强促血管生成信号传导从而促进肿瘤细胞生长、增殖、分化和存活。因此，靶向cd146是治疗肿瘤转移的一种潜在策略。

2、目前已有部分cd146抗体被用于肿瘤靶向治疗。例如m2j-1、tscd146、aa98等可以特异性识别cd146，并能抑制黑色素瘤、胰腺癌和乳腺癌等肿瘤的新生血管生成和肿瘤转移进程。但是，以上cd146抗体均属于单克隆抗体，存在着共性问题，即分子量大、容易引起免疫原性反应、不易通过血脑屏障、生产成本高等，这些缺点制约了单克隆抗体的临床推广。因此，寻求或设计一种能够克服上述问题的新型cd146抗体，已成为当前乳腺癌靶向治疗研究中至关重要的方向之一。

3、近年来，发现了一类新型抗体——纳米抗体，也称为单域抗体或vhh抗体。这种抗体分子非常小，存在于骆驼、羊驼和鲨鱼等生物体中，具有高度的特异性和穿透性。利用其分子特性，纳米抗体已被广泛应用于提高穿透性和作为特异性的影像示踪剂。相比单克隆抗体，纳米抗体在医学上有着更广泛的应用前景。

技术实现思路

1、鉴于cd146的潜在临床治疗价值和单克隆抗体的缺陷，本发明开展了cd146纳米抗体的合成研究，提供一类抗cd146跨膜受体的纳米单域抗体，以期能够制备出具有更高效性和特异性的治疗和检测工具。

2、为了解决上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供了一类抗cd146跨膜受体的纳米单域抗体，所述纳米抗体包括互补决定区cdr，所述互补决定区cdr包括氨基酸序列如下述(1)-(3)中的一种：

4、(1)seq id no：8所示的cdr1、seq id no：10所示的cdr2、seq id no：12所示的cdr3；

5、(2)seq id no：15所示的cdr1、seq id no：17所示的cdr2、seq id no：19所示的cdr3；

6、(3)seq id no：22所示的cdr1、seq id no：24所示的cdr2、seq id no：26所示的cdr3。

7、进一步的，所述纳米抗体还包括框架区fr，所述框架区fr包括氨基酸序列如下述(1)-(4)中的一种：

8、(1)seq id no：7所示的fr1、seq id no：9所示的fr2、seq id no：11所示的fr3、seq id no：13所示的fr4；

9、(2)seq id no：14所示的fr1、seq id no：16所示的fr2、seq id no：18所示的fr3、seq id no：20所示的fr4；

10、(3)seq id no：21所示的fr1、seq id no：23所示的fr2、seq id no：25所示的fr3、seq id no：27所示的fr4。

11、进一步的，所述纳米抗体的氨基酸序列如下述(1)-(3)中的一种：

12、(1)seq id no：1所示；

13、(2)seq id no：2所示；

14、(3)seq id no：3所示。

15、将其分别编号为161，432-1，469-2。

16、本发明还提供了上述编码基因，如下述(1)-(3)中的一种：

17、(1)seq id no：4所示；

18、(2)seq id no：5所示；

19、(3)seq id no：6所示。

20、本发明还提供了上述编码基因的表达盒。

21、本发明还提供了上述编码基因的重组载体。

22、本发明还提供了上述编码基因的宿主细胞。

23、本发明还提供了含有上述纳米抗体的抗体偶联物。

24、具体的，该抗体偶联物含有：(a)cd146纳米抗体112-2的vhh链、cd146纳米抗体112-2；和(b)选自下组的偶联部分：药物、放射性核素、可检测标记物、细胞因子、毒素、或酶等。

25、本发明还提供了上述纳米抗体、编码基因、表达盒、重组载体、宿主细胞的应用，用于制备检测或治疗癌症的制剂。

26、进一步的，上述癌症包括乳腺癌在内的所有癌症。

27、进一步的，上述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。

28、本发明还提供了上述纳米抗体、编码基因、表达盒、重组载体、宿主细胞的应用，用于制备抑制炎症的药物。

29、本发明公开了上述纳米抗体的制备和筛选过程。

30、本发明公开了上述纳米抗体作为检测性抗体的应用，并验证了其特异性。

31、特别的，本发明还公开了上述纳米抗体在肿瘤细胞治疗中的作用。其中，肿瘤细胞指三阴性乳腺癌细胞系。

32、本发明还提供了上述抗体偶联物的另一种应用，用于靶向cd146蛋白，并发挥偶联物的治疗效果或其他作用。

33、通过抗体偶联物(a)部分的抗体特异性识别cd146蛋白，再将偶联(b)部分的药物、放射性核素、可检测标记物、细胞因子、毒素、或酶等精准地作用于cd146蛋白，达到精准作用的目的。

34、实施本发明，具有如下有益效果：

35、本发明开展了cd146纳米抗体的合成研究，提供一类抗cd146跨膜受体的纳米单域抗体，实验发现3种纳米抗体均可作为cd146的检测性抗体，特异性强，可识别cd146胞外段的c1c2c3区。另一方面，发现mda-mb-231细胞被纳米抗体161处理后，三阴性乳腺癌细胞的迁移能力明显受抑制。第三方面，发现纳米抗体161可以拮抗il-6介导的炎症信号通路激活，有潜在的炎症抑制应用前景。纳米抗体432、469也具备相似的抑制癌细胞迁移与炎症信号通路激活效果。

技术特征：

1.一类抗cd146跨膜受体的纳米单域抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括互补决定区cdr，所述互补决定区cdr包括氨基酸序列如下述(1)-(3)中的一种：

2.如权利要求1所述抗cd146跨膜受体的纳米单域抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括框架区fr，所述框架区fr包括氨基酸序列如下述(1)-(4)中的一种：

3.如权利要求1所述抗cd146跨膜受体的纳米单域抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如下述(1)-(3)中的一种：

4.一种含有如权利要求3所述抗cd146跨膜受体的纳米单域抗体的编码基因，其特征在于，如下述(1)-(3)中的一种：

5.一种含有如权利要求4所述编码基因的表达盒、表达载体或宿主细胞。

6.一种含有如权利要求3所述抗cd146跨膜受体的纳米单域抗体的抗体偶联物。

7.一种如权利要求1～3任一项所述纳米抗体、或如权利要求4所述编码基因、或如权利要求5所述表达盒、所述表达载体或所述宿主细胞、如权利要求6所述抗体偶联物的应用，其特征在于，用于制备检测或治疗癌症的药物。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述癌症包括乳腺癌。

9.一种如权利要求1～3任一项所述纳米抗体、或如权利要求4所述编码基因、或如权利要求5所述表达盒、所述表达载体或所述宿主细胞、如权利要求6所述抗体偶联物的应用，其特征在于，用于制备抑制炎症的药物。

10.一种如权利要求6所述抗体偶联物的应用，其特征在于，用于靶向cd146蛋白。

技术总结
本发明公开了一类抗CD146跨膜受体的纳米单域抗体，所述纳米抗体包括互补决定区CDR，所述互补决定区CDR包括氨基酸序列如下述(1)‑(3)中的一种：(1)SEQ ID NO：8所示的CDR1、SEQ ID NO：10所示的CDR2、SEQ ID NO：12所示的CDR3；(2)SEQ ID NO：15所示的CDR1、SEQ ID NO：17所示的CDR2、SEQ ID NO：19所示的CDR3；(3)SEQ ID NO：22所示的CDR1、SEQ ID NO：24所示的CDR2、SEQ ID NO：26所示的CDR3。实验发现3种纳米抗体均可作为CD146的检测性抗体，特异性强，可识别CD146胞外段的C1C2C3区。另一方面，发现MDA‑MB‑231细胞被纳米抗体161处理后，三阴性乳腺癌细胞的迁移能力明显受抑制，推测另外2个具备相似的效果。同时，发现161能够抑制细胞对炎症因子的应答，推测另外2个同样具备类似效果。

技术研发人员：林豪雨,梁元科,曾德,孙何兴,黄锴源,周晓玲
受保护的技术使用者：汕头大学医学院第一附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16