一种用于检测KMT2A-PTD融合基因的试剂盒、其方法和应用与流程

本发明属于分子生物学检测，具体涉及一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒、其方法和应用。

背景技术：

1、急性白血病(acute leukemia，al)是一类造血干细胞来源恶性克隆性血液系统疾病。临床上以贫血、出血、感染和髓外浸润为主要表现，病情进展迅速，死亡率高。kmt2a(histone-lysine n-methyltransferase 2a)基因定位于11号染色体长臂2区3带(11q23)，片段大小为92kb，至少包括36个外显子，是血液系统恶性疾病中常累及的基因之一。大多数发生kmt2a基因异常的急性白血病的预后较差。kmt2a的部分串联重复(partial tandemduplication，ptd)是kmt2a基因片段exon 3-9插入exon 9、10、11或12之后形成的一种kmt2a内部基因改变的异常现象，kmt2a和ptd发生融合形成kmt2a-ptd融合基因，该融合基因与临床不良结果相关，多数患者对常规化疗耐药，即使做异基因造血干细胞移植也容易复发，是一个独立的预后不良因素。

2、因此，亟需一种对kmt2a-ptd融合基因进行检测的产品。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术中对kmt2a-ptd融合基因检测灵敏度低、特异性不高的缺陷。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，所述试剂盒至少包含引物对和探针，所述引物对包含第一正向引物、第二正向引物和反向引物；

3、其中，所述第一正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第二正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.4所示。

4、较佳地，所述引物对和探针溶于pcr反应液中，浓度分别为

5、较佳地，所述探针的5’端标记fam荧光基团，所述探针的3’端标记bhq1淬灭基团。

6、较佳地，所述试剂盒还包含参考基因扩增检测试剂组，其包括用于扩增参考基因的引物和探针，所述参考基因为abl1基因。

7、较佳地，所述用于扩增参考基因的引物的核苷酸序列如seq id no.5和seq idno.6所示，所述用于扩增参考基因的探针的核苷酸序列如seq id no.7所示。

8、较佳地，所述试剂盒还包含阳性对照，所述阳性对照为包含kmt2a-ptd融合基因基因组片段的质粒和abl1基因的质粒。

9、较佳地，所述试剂盒还包含阴性对照，所述阴性对照为包含abl1基因的质粒。

10、本发明还提供了一种非诊断目的检测kmt2a-ptd融合基因的方法，所述方法包含以下步骤：

11、s1，提供一微滴式数字pcr系统，其包含微滴生成仪、封膜仪、微滴读取仪；

12、s2，从待测样本中提取rna，将rna逆转录为cdna，对cdna进行扩增得到反应液；

13、s3，将所述反应液置于所述微滴生成仪中进行乳化，所述反应液形成10000～20000个微滴，将每一个微滴置于不同的反应单元中，使每一个反应单元包含一个或多个拷贝的核酸分子；

14、s4，利用所述封膜仪对每一个反应单元进行封膜；

15、s5，封膜结束后，利用上述任意一项所述的试剂盒中的引物对每一个反应单元中的kmt2a-ptd融合基因进行pcr扩增，利用上述任意一项所述的试剂盒中的探针对扩增产物进行特异性位点检测，利用所述微滴读取仪对每一个反应单元进行荧光信号的统计，根据pcr扩增后荧光信号的强弱对kmt2a-ptd融合基因进行定性和/或定量检测。

16、较佳地，所述pcr扩增的条件为：step1，95℃10分钟；step2，94℃15秒和58℃60秒，扩增反应40个循环；step3，98℃10分钟。

17、本发明还提供了一种如上任意一项所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒的应用，所述试剂盒用于检测kmt2a-ptd融合基因。

18、本发明的有益效果：

19、(1)本发明针对kmt2a-ptd融合基因设计了适用于微滴式数字pcr系统的第一正向引物seq id no.1序列、第二正向引物seq id no.2序列、反向引物seq id no.3序列、探针seq id no.4序列，可以避免引物结合非目标位点，提高多剪切位点的检出灵敏度，从而进一步提高试剂盒的检测精确度；进一步地，利用微滴式数字pcr系统对kmt2a-ptd融合基因进行检测，微滴式数字pcr在检测的过程中将待测样品分配到大量独立、平行的微反应单元中，每个微反应单元独立检测目的基因，相较于现使用的定性和定量pcr技术，微滴式数字pcr根据每个微反应单元内样品dna拷贝的绝对计数，而无需依赖内参和另外制备标准曲线，大大提高了检测的灵敏度，尤其对于浓度较低的样本来说更易检出，该方法快速准确、灵敏度高、特异性强。

20、(2)本发明设计的试剂盒可以从白血病患者骨髓样本中提取的rna转录cdna中检测相关融合基因，其最低检出限可以达到10个拷贝，有助于临床上白血病患者体内kmt2a-ptd融合基因的微量残留检测，对于及时干预治疗、避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后都具有重要的意义，检测方法简便，适宜临床应用。

21、(3)现有检测技术中所需要的最低有效模板量为300～500ng rna，而本发明设计的引物是适用于微滴式数字pcr系统，当待测样本的dna浓度被稀释到很低水平时，样本溶液被分散到大量的反应单元中，使每个反应单元所含有的dna分子数最多只有一个，本发明所需要的有效模板量大大降低，其最低有效模板量为100ng rna，即可实现目的基因的快速准确检测。

技术特征：

1.一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含引物对和探针，所述引物对包含第一正向引物、第二正向引物和反向引物；

2.如权利要求1所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述引物对和探针溶于pcr反应液中，浓度分别为30μm～80μm。

3.如权利要求1所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记fam荧光基团，所述探针的3’端标记bhq1淬灭基团。

4.如权利要求1所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含参考基因扩增检测试剂组，其包括用于扩增参考基因的引物和探针，所述参考基因为abl1基因。

5.如权利要求4所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增参考基因的引物的核苷酸序列如seq id no.5和seqid no.6所示，所述用于扩增参考基因的探针的核苷酸序列如seq id no.7所示。

6.如权利要求4所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阳性对照，所述阳性对照为包含kmt2a-ptd融合基因基因组片段的质粒和abl1基因的质粒。

7.如权利要求4所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阴性对照，所述阴性对照为包含abl1基因的质粒。

8.一种非诊断目的检测kmt2a-ptd融合基因的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的条件为：step1，95℃10分钟；step2，94℃15秒和58℃60秒，扩增反应40个循环；step 3，98℃10分钟。

10.一种如权利要求1～7中任意一项所述的用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测kmt2a-ptd融合基因。

技术总结
本发明公开了一种用于检测KMT2A‑PTD融合基因的试剂盒、其方法和应用，所述试剂盒至少包含引物对和探针，所述引物对包含第一正向引物、第二正向引物和反向引物；其中，所述第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明设计的引物对和探针适用于微滴式数字PCR系统，检测时将反应液乳化成微滴，每一个微滴置于不同的反应单元进行独立检测，对于浓度较低的样本更易检出，提高了检测的灵敏度，进一步提升了检测的精确度，具有自动化程度高、操作简单的优势，更适合用于临床上白血病患者体内KMT2A‑PTD融合基因的微量残留检测。

技术研发人员：王小蕊,童茵,杨隽,李会丹,娄加陶
受保护的技术使用者：上海市第一人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15