一种快速鉴别茶梅品种的SSR标记引物、方法及应用与流程

本发明涉及茶梅品种鉴别技术，建立了一种快速鉴别茶梅品种的ssr标记引物、方法及应用，属于生物。

背景技术：

1、茶梅(camellia sasanqua)为山茶科(theaceae)山茶属植物，不同于山茶(c.japonica)和滇山茶(c.reticulata)品种群主要在春季开花的特性，茶梅花期较长，适宜栽培条件下其群体花期从秋季到翌年春季，且以秋冬季为主，同时茶梅具有花量繁多的特性，观赏价值较高；此外，茶梅叶片较小，革质，枝叶具绒毛，喜光耐荫，耐修剪，抗旱性、抗病虫性等抗性较强。茶梅在长期的栽培、应用历史过程中形成了大量色彩丰富、姿态各异的品种，已成为是盆栽和园林绿化的重要花卉种类，在花卉生产中占有十分重要的地位。

2、茶梅种内个体间形态上的差异和变异在自然界中普遍存在，由于自然杂交和人工选育的影响更增添了变异的多样性和复杂性，增加了形态学分类的困难。同时随着茶梅种质资源的广泛征集和不断累积交换，出现大量同名异物和同物异名的现象，给生产、研究均带来了极大的不便和混乱，因此利用最新的分子标记技术对茶梅种质资源进行研究是十分必要。建立快速、高效、准确的茶梅品种鉴别技术，有望为品种交流、研究及推广应用提供技术支撑和科学依据。

3、茶梅品种的鉴别，专业技术人员通常根据经验从外观形态上加以判定，往往会造成主观性带来的误判；通过观测数据定性或者定量综合判定，通常需要一个生长季或某个特定生长发育时期(花、果实、种子)的数据观测收集，茶梅种子苗从播种到开花往往需要6年以上，因此缺乏时效性和准确性，此外，表型性状易受栽培管理和环境条件的影响。因此，对形态性状相近的茶梅品种难以进行有效鉴定与选择。利用dna分子标记进行鉴定，具有即时、高效、直观、准确的特点，不仅能更快速、准确地对相似种质进行鉴别，还可揭示种质中发生和存在的基因变异，为重要性状基因的定位提供指导，为茶梅资源的可持续利用提供科学依据。

4、ssr标记也称微卫星dna(microsatellite dna)，与其它分子标记相比，ssr标记以孟德尔方式遗传，呈共显性；数量丰富，多态性高；多等位基因，信息量大；同时还具有重复性好、可靠性强等特点，广泛应用于种质资源鉴别、遗传多样性与遗传结构分析及遗传图谱构建等方面。目前，ssr分子鉴别技术主要应用于农作物及各种经济作物中，利用ssr分子标记技术鉴别茶梅品种的相关报道较少，且能鉴别的茶梅品种也有限。

5、本发明自主开发了3对ssr标记引物，通过高通量测序、ssr基因分型技术对10个茶梅品种进行了快速鉴别，为茶梅品种识别及进一步开发利用提供技术支撑。

技术实现思路

1、本发明提供3对自主开发设计的ssr标记引物，通过ssrseqtm技术将高通量测序与ssr基因分型技术结合，实现对茶梅品种快速、准确及高效的鉴别，为茶梅品种高效识别提供技术支持与科学依据。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、茶梅品种ssr标记引物为自主开发，所述引物具体如下：

4、引物编号：ssr503，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、引物编号：ssr528，上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；

6、引物编号：ssr537，上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。

7、ssr标记引物在鉴别茶梅品种上的应用，通过ssrseqtm技术对茶梅品种进行快速鉴别。鉴别茶梅品种的方法，具体如下：

8、dna提取：使用dna提取试剂盒提取茶梅品种新鲜叶片中的dna。

9、dna质量评估：用琼脂糖凝胶电泳检查核酸的完整性，条带应清晰，无核酸降解和核酸污染。用nanodrop2000评估dna纯度，dna浓度≥20ng/μl，含量≥(200+n*30)ng(n为panel数目)。

10、pcr扩增：用ssr503、ssr528和ssr537引物位点对10个茶梅品种进行单一或多重pcr反应扩增。

11、高通量测序：将所有pcr产物汇集，并制备文库，在illuminahiseq2500(pe150bp)平台上测序。对原始读数经过一系列分析，包括使用fastqc的质量控制、用flash对reads进行合并，使用blastn构建参考比对。

12、ssr基因分型：通过比对reads和序列数据计算ssr等位基因的数量。两步校正后列出了ssr基序和重复数，包括滑移调整和扩增效率调整。

13、茶梅品种鉴别：根据同一引物不同茶梅品种的ssr基因分型不同，即可有效鉴别不同品种。

14、本发明获得的有益效果：

15、茶梅品种ssr分子标记鉴别所用ssr引物为本实验室自主开发设计，引物信息见表1。

16、表1茶梅品种ssr引物

17、

18、根据同一引物不同茶梅品种的ssr基因分型不同，即可有效鉴别不同品种。利用本实验室自主开发的81对引物对160个茶梅品种进行基因分型鉴定，筛选出3对ssr引物可分别对10个茶梅品种实现一一区分。

19、本发明利用3对自主开发ssr引物对茶梅品种的dna进行高通量测序、ssr基因分型，能有效鉴别10个茶梅品种。1、本发明得到的ssr标记分型图谱特异性强、多态性高。2、本发明自主开发的3对ssr引物均可以一次性将10个茶梅品种全部一一区分，鉴别效率高；3对ssr引物可单独用于鉴定，亦可同时进行多重pcr反应，少量扩增循环数即可获得高多态性分型图谱，大大缩短了反应时间，可实现茶梅品种的快速鉴定。3、本方法所得数据基于生物信息学分析，不需人工判读基因型，流程高效，分型准确，减少了人工误差，与传统经验鉴别方法相比准确性高、可重复性强。4、本方法与观测数据定性或者定量综合判定方法相比，能够节约时间和成本。因此，利用本方法对茶梅品种的鉴别具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.茶梅品种ssr标记引物，其特征在于：3对引物均为自主开发引物，所述引物具体如下：

2.一种鉴定茶梅品种的方法，其特征在于：使用ssrseqtm技术对茶梅品种进行快速鉴别，鉴别方法具体如下：

3.根据权利要求1所述的茶梅ssr标记引物在快速鉴别茶梅品种中的应用。

技术总结
本发明涉及一种快速鉴别茶梅品种的方法，本发明提供了自主开发的3对SSR标记引物SSR503、SSR528、SSR537，并将它们应用于茶梅品种鉴别。具体根据同一引物不同茶梅品种的SSR基因分型不同，鉴别不同品种。本发明得到的3对SSR引物均可以一次性将10个茶梅品种全部一一区分，鉴别效率高。与传统经验鉴别方法相比准确性高、可重复性强。与观测数据定性或者定量综合判定方法相比，能够节约时间和成本。因此，利用本方法对茶梅品种的鉴别具有广阔的应用前景，为茶梅品种有效识别及进一步开发利用提供技术支撑与科学依据。

技术研发人员：张莹,李辛雷,宋志欣,刘文佳,范梦龙,吴思
受保护的技术使用者：中国林业科学研究院亚热带林业研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15