一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法与流程

本发明涉及吡咯喹啉醌生产，具体涉及一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法。

背景技术：

1、吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，pqq)，化学名称为4,5二氢4,5二氧化1氢吡咯(2,3f)醌2,7,9三羧酸，别名methaxatin，是一种新型辅酶。1979年salisbury等人首次从甲基营养菌中分离，并确定其为在细菌细胞中作为膜结合脱氢酶的氧化还原辅因子，它与呼吸链电子传递，也是一种新的b族维生素。新近一些研究发现pqq具有异常高的氧化还原循环能力，在抗神经细胞衰老和抗癌等方面有很大应用潜力。

2、目前，pqq的生产方法主要是化学合成法及发酵法，化学合成法步骤多、副产物多且难以去除，在国内安全环保要求越来越严格的情况下，微生物发酵法生产pqq具有巨大的成本优势。

3、从发酵液中提纯pqq是研究重点之一，中国cn111635402a公开了一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，含有吡咯喹啉醌的发酵液经过滤得到的滤液在酸性条件下除蛋白质后，经超滤和纳滤浓缩，得到吡咯喹啉醌浓缩液，向浓缩液中加入草酸，并控制体系ph为2.0-3.0，用有机溶剂萃取，得到萃取液；用ph为2.0-3.0的缓冲液对萃取液进行反萃取，得到反萃液，将反萃液进行结晶，得到粗品晶体；对粗品晶体实施脱色处理和重结晶，得到吡咯喹啉醌产品。本专利虽然工艺简单易操作，周期短，但是用草酸调ph,其具有强烈的腐蚀性，对后期萃取罐的材质具有高的要求，且用到正丁醇做萃取剂，正丁醇具有强烈的刺激性气味，毒性比较高，并且对正丁醇的回收一般采用减压蒸馏的方式，所需的设备比较复杂，成本比较高，另外吡咯喹啉醌的收率低。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，吡咯喹啉醌的收率低，生产成本低，工艺简单。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

3、一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，包括以下步骤：

4、a：将吡咯喹啉醌含量为2.0～3.0g/l的发酵液用盐酸调节ph为2.0～3.0，然后加入絮凝剂，在25～35℃下静置10～20min，然后加入助滤剂，过滤后得滤液；

5、b：滤液过超滤膜，收集超滤清液；

6、c：超滤清液过纳滤膜，收集纳滤浓液；

7、d：纳滤浓液进模拟移动床,收集含吡咯喹啉醌合格液，

8、e：将含吡咯喹啉醌合格液在温度50-70℃，真空度＜-0.090mpa的条件下进行浓缩，得浓缩液，向浓缩液中加入柠檬酸，调节其ph值为1.5～3.5，然后加入异丙醇进行多级逆流萃取，得到萃取液；

9、f：将萃取液中加入氯化钠与磷酸氢钠混合溶液，然后用酸调至ph为1.5～3.5，进行多级逆流萃取，得反萃液；

10、g：将反萃液在在温度50～70℃，真空度＜-0.090mpa的条件下进行浓缩，浓缩至有晶体析出时，以1～5℃/h的速度降温至10～15℃，抽滤，得到吡咯喹啉醌粗品；

11、h：将得到的吡咯喹啉醌粗品加入纯化水，在40～60℃的条件下，进行溶解，溶解澄清后，然后加入活性炭，搅拌30min，过滤，然后以3～5℃/h降温至5～10℃，抽滤，湿品用冷水洗涤，再次抽滤，烘干得吡咯喹啉醌成品。

12、优选的，步骤a中絮凝剂为聚合氯化铝或氯化亚铁中的一种，絮凝剂的加入量为发酵液体积1～5％v/v，絮凝剂的浓度为0.1～0.5％g/l；

13、助滤剂为硅藻土或珍珠岩中的一种，助滤剂的加入量占发酵液体积的5～10％g/l。

14、优选的，步骤b中超滤膜的孔径为5000～10000da。

15、优选的，步骤c中纳滤膜的孔径为100-300da。

16、优选的，步骤b中的超滤浓液用盐酸调节ph至2.0～3.0，然后加入占超滤浓液体积1～5％v/v、浓度为0.1～0.5％g/l的絮凝剂，在30℃条件下静置10～20分钟，过滤后液体与步骤c中的纳滤清液混合后用于絮凝剂的配制，其中絮凝剂为聚合氯化铝或氯化亚铁中的一种。

17、优选的，步骤d中移动床色谱系统的洗脱液为0.1～0.5mol/l磷酸盐缓冲液，其固定相为硅胶，操作参数为进料温度为0～30℃，洗脱剂进料流速为1～5ml/min，进料液流速为1～5ml/min。

18、优选的，步骤e中浓缩液的固含量为70～90％w/w，柠檬酸的浓度为0.1～0.5mol/l，异丙醇的加入量为浓缩液体积的1.0～3.0倍。

19、优选的，步骤f中氯化钠与磷酸氢钠混合溶液的加入量为萃取液体积的0.5～1.5倍，氯化钠与磷酸氢钠混合溶液中溶质的质量分数为5～10％w/w，氯化钠与磷酸氢钠混合溶液中氯化钠与磷酸氢钠的质量比为1:2～5。

20、优选的，步骤f中的酸为盐酸或草酸中的一种。

21、优选的，步骤h中活性炭的加入量占吡咯喹啉醌粗品重量的0.1～0.5％w/w，纯化水的加入量为吡咯喹啉醌粗品重量的1.0～3.0倍。

22、由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

23、1、通过在发酵液调节ph值，加入絮凝剂能够有效地使蛋白质、金属离子沉淀，结合助滤剂能够更好的除去吡咯喹啉醌发酵液中的杂质，从而能够更好的减少后续处理步骤，提高吡咯喹啉醌产品的纯度和收率。

24、2、本发明采用超滤方式，将发酵液中的蛋白质进一步去除进，一步提高其吡咯喹啉醌的纯度，在通过纳滤方式，起到浓缩的作用，减少后期浓缩的成本。

25、3、本发明用异丙醇作为萃取剂，其成本低廉，毒性比较低，后期回收只需采用蒸馏的方式，其设备比较普遍，操作比较简单，回收出的异丙醇，可以循环利用，减少生产成本，且通过多级逆流萃取，萃取收率≥98％，原料利用率高。

26、4、反萃过程中使用氯化钠，加入氯化钠可以提高吡咯喹啉醌在反萃液中的溶解度，避免在反萃过程中析出，通过调节氯化钠与碳酸氢钠的添加比例和多级逆流萃取的相结合的方式，使脂溶性的杂质更多的留在有机相中，进一步提纯和浓缩，其萃取收率≥98％。

27、5、吡咯喹啉醌粗品加入纯化水溶解，并采用活性炭脱色，抽滤，湿品用冷水洗涤，再次抽滤，烘干得吡咯喹啉醌成品，通过多次洗涤，得到的吡咯喹啉醌产品纯度高，同时不用醇洗涤，减少了后续对醇的回收步骤，也节约了成本。

28、6、本发明简单易操作，周期短，且各步骤协同配合，整个工艺所用试剂和溶剂的量大大减少，且所用试剂和溶剂来源广泛，成本低廉，毒性较低，能够显著降低成本并减少环保压力；并且本发明分离纯化方法能够实现对吡咯喹啉醌的高效提取，兼顾达到较高的纯度和收率。

技术特征：

1.一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，其特征在于：步骤a中絮凝剂为聚合氯化铝或氯化亚铁中的一种，絮凝剂的加入量为发酵液体积1～5％v/v，絮凝剂的浓度为0.1～0.5％g/l；

3.如权利要求1所述的一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，其特征在于：步骤b中超滤膜的孔径为5000～10000da。

4.如权利要求1所述的一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，其特征在于：步骤c中纳滤膜的孔径为100-300da。

5.如权利要求1所述的一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，其特征在于：步骤b中的超滤浓液用盐酸调节ph至2.0～3.0，然后加入占超滤浓液体积1～5％v/v、浓度为0.1～0.5％g/l的絮凝剂，在30℃条件下静置10～20分钟，过滤后液体与步骤c中的纳滤清液混合后用于絮凝剂的配制，其中絮凝剂为聚合氯化铝或氯化亚铁中的一种。

6.如权利要求1所述的一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，其特征在于：步骤d中移动床色谱系统的洗脱液为0.1～0.5mol/l磷酸盐缓冲液，其固定相为硅胶，操作参数为进料温度为0～30℃，洗脱剂进料流速为1～5ml/min，进料液流速为1～5ml/min。

7.如权利要求1所述的一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，其特征在于：步骤e中浓缩液的固含量为70～90％w/w，柠檬酸的浓度为0.1～0.5mol/l，异丙醇的加入量为浓缩液体积的1.0～3.0倍。

8.如权利要求1所述的一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，其特征在于：步骤f中氯化钠与磷酸氢钠混合溶液的加入量为萃取液体积的0.5～1.5倍，氯化钠与磷酸氢钠混合溶液中溶质的质量分数为5～10％w/w，氯化钠与磷酸氢钠混合溶液中氯化钠与磷酸氢钠的质量比为1:2～5。

9.如权利要求1所述的一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，其特征在于：步骤f中的酸为盐酸或草酸中的一种。

10.如权利要求1所述的一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，其特征在于：步骤h中活性炭的加入量占吡咯喹啉醌粗品重量的0.1～0.5％w/w，纯化水的加入量为吡咯喹啉醌粗品重量的1.0～3.0倍。

技术总结
本发明公开了一种吡咯喹啉醌分离纯化的方法，涉及吡咯喹啉醌生产技术领域，含有吡咯喹啉醌的发酵液用盐酸调节pH至酸性后加入絮凝剂，能够有效地使蛋白质、金属离子沉淀，静置一段时间后加入助滤剂，结合助滤剂能够更好的除去吡咯喹啉醌发酵液中的杂质，然后经超滤、纳滤后再进行浓缩，浓缩液经萃取和反萃进行提纯，最后经水洗，活性炭脱色，过滤，再次水洗及抽滤，烘干得到吡咯喹啉醌成品，工艺操作简单，生产成本低，得到的吡咯喹啉醌产品纯度高。

技术研发人员：朱理平,徐良平,邱崇顺
受保护的技术使用者：诸城市浩天药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15