一种L-苏氨酸产量提高的大肠杆菌的构建及应用

本发明涉及一种l-苏氨酸产量提高的大肠杆菌的构建及应用，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术：

1、l-苏氨酸(l-threonine)，中文别名α-氨基-β-羟基丁酸，分子式为c4h9no3，相对分子质量为119.12，为白色晶体或晶体状粉末，无刺激性气味，易溶于水，几乎不溶于有机溶剂。溶液呈酸性，ph为5.0-6.5。具有旋光性。苏氨酸存在四种同分异构体，但是天然存在且对人体具有生理作用的只有l-苏氨酸。l-苏氨酸作为一种必需氨基酸，人体内无法合成，需要从外界摄入。

2、生物膜是由胞外多糖和蛋白质组成的自身产生的胞外聚合物(eps)包裹的细菌细胞群落。生物膜形成是大肠杆菌的一种自然的生长方式，致病性大肠杆菌菌株利用生物膜来保护自己免受宿主免疫反应和抗菌剂的伤害。大肠杆菌生物膜的形成也是一个多步骤的过程。第一阶段包括趋化运动，通过泳动和聚集以寻找有利的固定表面，在到达这些表面后，大肠杆菌细胞失去它们的鞭毛并形成聚集体，随后产生eps，因此，对鞭毛运动的抑制是菌体的聚集和生物膜形成的重要步骤。twf001作为一株l-苏氨酸生产菌，精简菌体非必要的胞外结构，降低致病力，对促进产物合成及提高生产安全性尤为重要。

技术实现思路

1、为了解决上述存在的技术问题，本发明在大肠杆菌twf001中通过单独敲除以及组合敲除与菌体运动性和生物膜形成相关的基因nlpe、csrb和/或qsebc，构建得到的重组大肠杆菌在发酵36h的l-苏氨酸产量相对twf001有所提高。

2、本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，以l-苏氨酸生产菌株为宿主，敲除基因组上影响菌体运动及生物膜形成的调控基因nlpe，qsebc，csrb中的一种或多种。

3、在一种实施方式中，所述qsebc包括qsec和qseb。

4、在一种实施方式中，所述nlpe，qseb，qsec序列的ncbi登录号分别为aaa86093.1，aaa69193.1，aaa69194.1。

5、在一种实施方式中，所述csrb的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、在一种实施方式中，所述l-苏氨酸生产菌株为大肠杆菌twf001。

7、本发明的第二个目的是提供一种提高l-苏氨基酸产量的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上影响菌体运动及生物膜形成的调控基因。

8、在一种实施方式中，所述影响菌体运动及生物膜形成的调控基因包括nlpe，qsebc，csrb中的一种或多种。

9、在一种实施方式中，所述qsebc包括qsec和qseb。

10、在一种实施方式中，所述nlpe，qseb，qsec序列的ncbi登录号分别为aaa86093.1，aaa69193.1，aaa69194.1。

11、在一种实施方式中，所述csrb的核苷酸序列如seq id no.1所示。

12、在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌twf001。

13、本发明的第三个目的是提供一种发酵制备l-苏氨酸的菌剂，所述菌剂含有所述重组大肠杆菌。

14、在一种实施方式中，所述菌剂中还含有冻干保护剂。

15、在一种实施方式中，所述冻干保护剂包括脱脂奶粉、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、甘露醇或乳糖中的一种或多种。

16、本发明的第四个目的是提供一种合成l-苏氨酸的方法，所述方法为利用所述重组大肠杆菌或所述菌剂发酵制备l-苏氨酸。

17、在一种实施方式中，所述方法为将所述重组大肠杆菌的种子液接种于以葡萄糖为碳源的反应体系中发酵制备l-苏氨酸。

18、在一种实施方式中，所述方法为将所述重组大肠杆菌在平板上活化培养24小时，挑单菌落接种到5ml试管中，置于37℃，200rpm条件下培养12小时得到一级种子液，初始od600为0.1接种于stf培养基，置于37℃，200rpm条件下培养4小时得到二级种子液，最后以od600为0.2接种于发酵培养基，置于37℃，200rpm条件下培养36小时。

19、在一种实施方式中，所述发酵培养基组成包括：1～5g/l酵母粉，1～5g/l柠檬酸，20～30g/l nh4so4，5～10g/l kh2po4，1～5g/l mgso4·7h2o，2～7mg/l feso4·7h2o，2～7mg/l mnso4·4h2o，20～60g/l葡萄糖和10～30g/l caco3。

20、在一种实施方式中，所述stf培养基组成包括：5～15g/l蔗糖，10～30g/l蛋白胨，1～10g/l酵母粉，10～20g/l nh4so4和0.5～1.5g/l mgso4。

21、本发明还提供所述重组大肠杆菌或上述菌剂或上述方法在制备l-苏氨酸中的应用。

22、有益效果

23、本发明在大肠杆菌twf001中通过单独敲除以及组合敲除与菌体运动性和生物膜形成相关的基因nlpe、csrb和/或qsebc，筛选出twf001-nqc l-苏氨酸产量在摇瓶发酵36h后达到17.9g·l-1，转化率达到0.445g·g-1葡萄糖，l-苏氨酸产量相对twf001提高55.7％。其余重组大肠杆菌twf001-n、twf001-q、twf001-c、twf001-nq、twf001-nc、twf001-qc的l-苏氨酸产量分别达到12.98g·l-1，14.1g·l-1，12.17g·l-1，15.03g·l-1，14.55g·l-1，15.65g·l-1，均高于对照菌株twf001。因此，本发明提供了一种提高大肠杆菌中l-苏氨酸产量的新策略。

24、生物材料

25、大肠杆菌twf001已公开在2018年发表的论文《increasing l-threonineproduction in escherichia coli by engineering the glyoxylate shunt and the l-threonine biosynthesis pathway》中。

技术特征：

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以l-苏氨酸生产菌株为宿主，敲除基因组上影响菌体运动及生物膜形成的调控基因nlpe，qsebc，csrb中的一种或多种，所述qsebc包括qsec和qseb。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述nlpe，qseb，qsec序列的ncbi登录号分别为aaa86093.1，aaa69193.1，aaa69194.1；所述csrb的核苷酸序列如seq idno.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述l-苏氨酸生产菌株为大肠杆菌twf001。

4.一种提高l-苏氨基酸产量的方法，其特征在于，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上影响菌体运动及生物膜形成的调控基因；所述影响菌体运动及生物膜形成的调控基因包括nlpe，qsebc，csrb中的一种或多种；所述qsebc包括qsec和qseb。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述nlpe，qseb，qsec序列的ncbi登录号分别为aaa86093.1，aaa69193.1，aaa69194.1；所述csrb的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6.一种发酵制备l-苏氨酸的菌剂，其特征在于，含有权利要求1～3任一所述重组大肠杆菌。

7.一种合成l-苏氨酸的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌或权利要求6所述菌剂发酵制备l-苏氨酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌的种子液接种于以葡萄糖为碳源的反应体系中发酵制备l-苏氨酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应体系包括：1～5g/l酵母粉，1～5g/l柠檬酸，20～30g/l nh4so4，5～10g/l kh2po4，1～5g/l mgso4·7h2o，2～7mg/lfeso4·7h2o，2～7mg/l mnso4·4h2o，20～60g/l葡萄糖和10～30g/l caco3。

10.权利要求1～3任一所述重组大肠杆菌或权利要求6所述菌剂或权利要求7～9任一所述方法在制备l-苏氨酸中的应用。

技术总结
本发明公开了一种L‑苏氨酸产量提高的大肠杆菌的构建及应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明在大肠杆菌TWF001中通过单独敲除以及组合敲除与菌体运动性和生物膜形成相关的基因nlpE、csrB和/或qseBC，获得的重组大肠杆菌L‑苏氨酸产量较出发菌株最高可提高55.7％。该研究提供了一种提高大肠杆菌中L‑苏氨酸产量的新策略。

技术研发人员：王小元,宫登科,宋杰
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15