一种鸡毛脚性状基因鉴定用的引物及鉴定方法

一种鸡毛脚性状基因鉴定用的引物及鉴定方法，具体涉及一种鸡毛脚性状基因鉴定用的引物及鉴定方法。

背景技术：

1、广西具有丰富的地方鸡种质资源，包括广西麻鸡、南丹瑶鸡、龙胜凤鸡等。其中南丹瑶鸡和龙胜凤鸡的胫部均具不同程度的羽毛量。毛脚是鸡比较典型的外貌特征，在一定程度上影响消费者的购买力。目前，广西地方鸡种并没有针对毛脚性状进行选育。根据市场需求，尤其在喜食鸡肉的两广地区，提供特定有无毛脚鸡的纯系鸡群体，有利于提高其市场销量。

2、家禽羽毛发育起始于毛囊。毛囊控制着羽毛的生长、更替及其形态结构。禽类毛脚属于皮肤附属物，在脊椎动物发育过程中，其通过外胚层表皮和中胚层真皮之间的相互作用形成，并且由来自真皮的信号决定了表皮附属物的命运。sun等利用连锁分析的方法，将与毛脚性状有关的基因组区域分别定位在8号染色体71cm、12号染色体4cm、13号染色体55cm、15号染色体47cm附近，由于标记密度和连锁分析的局限性，这些基因组区域置信区间较大，假阳性较高，且无法鉴定因果突变。相比连锁分析定位的qtl，利用全基因组关联分析(genome-wide association studies,gwas)可以实现对因果突变的精细定位。

技术实现思路

1、本发明为解决上述技术问题，提供一种成本低、操作简易的鸡毛脚性状基因鉴定用引物，及利用该引物进行鉴定鸡毛脚性状的方法。本发明前期利用gwas对广西地方鸡品种毛脚表型的分子标记进行定位，筛选到15号染色体上的snp与毛脚表型显著相关，同时发现了13号染色体上的一段缺失与毛脚显著相关。两个变异与sun等人的基因组区域存在重叠，可作为毛脚表型的候选因果突变，用于毛脚表型的基因型提纯。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

3、一种鸡毛脚性状基因鉴定用的引物，包括引物对ⅰ和引物对ⅱ；所述引物对ⅰ由上游引物f1、f2和下游引物r组成的2对引物，即上游引物f1+下游引物r、上游引物f2+下游引物r，用于验证13号染色体缺失(chr13_15461856-15493537)的引物对；所述上游引物f1与所述下游引物r是13号染色体缺失序列引物，所述上游引物f2与所述下游引物r是13号染色体非缺失序列引物；

4、所述引物对ⅱ由上游引物snp-f和下游引物snp-r组成的1对引物，用于验证15号染色体上的snp1 chr15_12355639；

5、所述引物对ⅰ和引物对ⅱ中涉及的引物核苷酸序列分别如seq id no.1～seq idno.5所示。

6、本发明解决技术问题所提供的另一技术方案为一种鸡毛脚性状基因的鉴定方法，包含以下步骤：

7、(1)待测个体的dna提取；

8、(2)特异性pcr扩增：以待检测个体的基因组dna为模板，采用所述鸡毛脚性状基因鉴定用的引物对ⅰ和引物对ⅱ进行pcr扩增；

9、(3)对于步骤(2)所得引物对ⅱ的pcr产物需进行酶切实验，酶切体系为：步骤(2)所得引物对ⅱ的pcr产物5μl，限制性内切酶(ecor v)1μl，buffer 1μl，超纯水12μl，37℃反应1.5h；

10、(4)凝胶电泳并显影判断：琼脂糖凝胶电泳后，根据电泳图谱与酶切结果判定个体的基因型和表型：13号染色体电泳结果中，若仅出现805bp的条带，表示为正常基因型；若显现两条带：974bp和805bp，表示为杂合基因型；若仅出现974bp条带，表示纯合缺失基因型；

11、snp分型结果中，若切出1条带：167bp，表示为正常基因型；若切出3条带：167bp、36bp、131bp，表示为杂合突变基因型；若切出2条带：36bp、131bp，表示纯合突变型；

12、琼脂糖凝胶电泳和snp分型结果均为正常基因型，则表示该个体为鳞片脚性状；若存在一处缺失或snp突变，表明其为鸡毛脚性状。

13、作为优选，步骤(1)中通过血液提取基因组dna，dna提取方法参考ezup柱式血液基因组dna抽提试剂盒。

14、作为优选，步骤(1)中提取的dna的浓度大于10ng/l，且od 260/od 280值为1.7～2.0；提取的dna浓度将会影响后续显影效果，如果dna浓度小于10ng/l，在后续的pcr扩增中相应片段扩增效果不好，会出现误判的情况。

15、作为优选，步骤(2)中所述引物对ⅰ的pcr扩增采用的pcr反应体系为20.0μl反应体系，包括10.0μl 2×santap pcr master mix、6.6μl ddh2o、50ng步骤(1)中提取所得待测个体的模板dna、所述引物对ⅰ涉及的3条引物各8.0pmol/l；所述引物对ⅱ的pcr扩增采用的pcr反应体系为20.0μl反应体系，包括10.0μl 2×santap pcr master mix、7.4μl ddh2o、50ng步骤(1)中提取所得待测个体的模板dna、所述引物对ⅱ涉及的2条引物各8.0pmol/l；

16、所述引物对ⅰ和所述引物对ⅱ的pcr反应程序皆为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；50-60℃退火温度30s，72℃延伸，60s/kb；72℃终延伸10min，共计35个循环。

17、作为优选，步骤(4)中，所述琼脂糖凝胶电泳的操作为：

18、(a)制胶：1.5％的琼脂糖凝胶40ml；

19、(b)上样：将marker、步骤(2)中所得引物ⅰ的pcr产物和步骤(3)中所得引物对ⅱ单酶切后产物各取6μl pcr产物进行加样；

20、(c)电泳：琼脂糖凝胶180v电泳15min。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果：

22、本发明通过设计适用于鸡毛脚性状基因的引物，并利用该引物进行pcr扩增，酶切和琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡毛脚性状基因。该方法能大大提高基因型的判定效率和准确性，且方法简便，分型时间短，不需要测序，不需要特殊的仪器，成本低，易推广普及。本发明建立的方法可以快速的鉴定鸡毛脚基因，扩大毛脚纯合基因的繁殖群体，缩短育种时间。

技术特征：

1.一种鸡毛脚性状基因鉴定用的引物，其特征在于：包括引物对ⅰ和引物对ⅱ；所述引物对ⅰ由上游引物f1、f2和下游引物r组成的2对引物，用于验证13号染色体缺失(chr13_15461856-15493537)的引物对；所述上游引物f1与所述下游引物r是13号染色体缺失序列引物，所述上游引物f2与所述下游引物r是13号染色体非缺失序列引物；

2.利用如权利要求1所述鸡毛脚性状基因鉴定用的引物对鸡毛脚性状基因的鉴定方法，其特征在于，包含以下步骤：

3.根据权利要求2所述鸡毛脚性状基因的鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中通过血液提取基因组dna，dna提取方法参考ezup柱式血液基因组dna抽提试剂盒。

4.根据权利要求2所述鸡毛脚性状基因的鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中提取的dna的浓度大于10ng/l，且od 260/od 280值为1.7～2.0。

5.根据权利要求2所述鸡毛脚性状基因的鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中所述引物对ⅰ的pcr扩增采用的pcr反应体系为20.0μl反应体系，包括10.0μl 2×santap pcr mastermix、6.6μl ddh2o、50ng步骤(1)中提取所得待测个体的模板dna、所述引物对ⅰ涉及的3条引物各8.0pmol/l；所述引物对ⅱ的pcr扩增采用的pcr反应体系为20.0μl反应体系，包括10.0μl2×santap pcr master mix、7.4μl ddh2o、50ng步骤(1)中提取所得待测个体的模板dna、所述引物对ⅱ涉及的2条引物各8.0pmol/l；

6.根据权利要求2所述鸡毛脚性状基因的鉴定方法，其特征在于：步骤(4)中，所述琼脂糖凝胶电泳的操作为：

技术总结
本发明公开了一种鸡毛脚性状基因鉴定用的引物，包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ；所述引物对Ⅰ由上游引物F1、F2和下游引物R组成的2对引物。利用所述引物对鸡毛脚性状基因的鉴定方法，包含以下步骤：(1)待测个体的DNA提取；(2)特异性PCR扩增；(3)对于步骤(2)所得引物对Ⅱ的PCR产物需进行酶切；(4)凝胶电泳并显影判断。本发明能大大提高基因型的判定效率和准确性，且方法简便，分型时间短，不需要测序，不需要特殊的仪器，成本低，易推广普及。本发明建立的方法可以快速的鉴定鸡毛脚基因，扩大毛脚纯合基因的繁殖群体，缩短育种时间。

技术研发人员：杨秀荣,杜文娅,杨祝良,邓继贤
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16