一种用于预测肝纤维化的肠道菌群组合物及其应用

本发明涉及一种用于预测肝纤维化的肠道菌群组合物及其应用，属于医学检验。

背景技术：

1、肝纤维化是指在慢性病理因素作用下，由多种因子表达异常导致肝内纤维组织异常增生，进而导致显微组织过度沉积发生肝纤维化。任何肝脏损伤在治疗的过程中都有肝纤维化的过程，是一个可逆的过程，但若长期不能得到治疗，肝纤维化将会进一步发展成肝硬化。肝纤维化是全球肝病死亡的主要原因，因此，及时改善肝纤维化以防止慢性肝病发展尤为重要。

2、肝纤维化的诊断方式一般分为创伤性诊断和非创伤性诊断。在创伤性诊断方面，通过肝组织活检确定纤维化的严重程度是诊断肝纤维化的金标准，然而，这是一个有创的检查，这限制其在临床方面的应用。在非创伤性诊断方面，许多非侵入性技术已被用于研究，如血清标记物、影像技术等。可靠的非侵入性肝纤维化评估工具的开发极大的提高了慢性肝病患者的临床决策，可对疾病分期和预后进行快速和准确的判断。最早应用于临床诊断较特异的标志物是透明质酸、层黏蛋白等但由于其特异性、敏感性和准确性均较差，逐渐被淘汰。

3、因此，寻找新的组合物用以预测肝纤维化是迫切需要解决的问题。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供了一种可准确预测肝纤维化的肠道菌群组合物。

2、技术方案：本发明的用于预测肝纤维化的肠道菌群组合物，乳酸杆菌属(lactobacillus)、杜氏乳杆菌属(dubosiella)、拟杆菌属(muribaculaceae)、毛螺菌属(lachnospiraceae)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)和粪杆菌属(faecalibaculum)。

3、优选地，所述菌群组合物为乳酸杆菌属(lactobacillus)、杜氏乳杆菌属(dubosiella)、拟杆菌属(muribaculaceae)、毛螺菌属(lachnospiraceae)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)和粪杆菌属(faecalibaculum)。

4、本发明的用于预测肝纤维化的肠道菌群组合物的筛选方法，包括以下步骤：

5、s1.采集健康人群、肝纤维化患者中段粪便组织样本，提取各粪便组织样本的总dna，用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提基因组dna；

6、s2.以步骤s1得到的合格的总dna为模板，进行细菌16srdna的v4可变区域pcr扩增，得到扩增产物，对扩增产物进行纯化回收、定量检测、建库并测序，得到各粪便组织样本的原始测序序列；

7、s3.对步骤s2得到的原始测序序列进行质控、拼接和过滤，得到优化序列，使用uparse软件根据97％的相似性对得到的优化序列进行otu聚类，在聚类过程中去除嵌合体序列，得到与otu代表序列相似性在97％以上的序列；

8、s4.采用贝叶斯算法对步骤s3中97％以上相似水平的otu代表序列进行分类学分析，比对silva 16srdna数据库和古菌核糖体silva数据库，设置比对阈值70％，分属统计得到肠道菌群中菌群的相对丰度信息；

9、s5.比对步骤s4中获得的健康人群和肝纤维化患者肠道菌群中菌群的相对丰度信息，根据差异表达最终获得关键肠道菌群。

10、优选地，步骤s2中所述pcr扩增使用的引物包括正向引物338f和反向引物806r；所述正向引物338f的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述反向引物806r的核苷酸序列如seqid no.2所示。

11、优选地，步骤s2中所述pcr扩增反应体系为：4μl 5×fastpfu缓冲液，2μl 2.5mmdntps，0.8μl5μm正向引物，0.8μl 5μm反向引物，0.4μl fastpfu聚合酶，10ng总dna，0.2μl牛血清蛋白，h2o补足至总体积20μl。

12、优选地，步骤s2中所述pcr扩增的程序为：循环95℃变性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。

13、优选地，步骤s2中所述纯化回收采用磁珠纯化回收；所述定量检测采用荧光定量检测。

14、优选地，步骤s3中所述对步骤s2得到的原始测序序列进行质控、拼接和过滤具体包括：采用fastqc软件对原始序列数据进行质量控制，通过usearch和vsearch软件获取引物的位置信息；采用dada2软件将测序获得的pereads拼接成一条序列，过滤低质量和重复的reads，去除嵌合体，修正扩增子的测序错误，最终得到优化序列。

15、优选地，步骤s5中所述关键肠道菌群为乳酸杆菌属(lactobacillus)、杜氏乳杆菌属(dubosiella)、拟杆菌属(muribaculaceae)、毛螺菌属(lachnospiraceae)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)和粪杆菌属(faecalibaculum)。

16、本发明的预测肝纤维化的试剂盒，所述试剂盒用于检测上述菌群组合物。

17、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明提供的用于预测肝纤维化的肠道菌群组合物，通过16srdna测序技术对健康人群和肝纤维化患者的中段粪便组织的肠道菌群进行测序，用关键菌群数据的升降，实现对肝纤维化的早期诊断和预测；其次，本发明在无创的条件下通过关键菌群数据的升降来预测是否患有肝纤维化，不会对患者机体造成伤害。

技术特征：

1.一种用于预测肝纤维化的肠道菌群组合物，其特征在于，所述菌群组合物包括以下六种菌属：乳酸杆菌属(lactobacillus)、杜氏乳杆菌属(dubosiella)、拟杆菌属(muribaculaceae)、毛螺菌属(lachnospiraceae)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)和粪杆菌属(faecalibaculum)。

2.根据权利要求1所述的用于预测肝纤维化的肠道菌群组合物，其特征在于，所述菌群组合物为乳酸杆菌属(lactobacillus)、杜氏乳杆菌属(dubosiella)、拟杆菌属(muribaculaceae)、毛螺菌属(lachnospiraceae)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)和粪杆菌属(faecalibaculum)。

3.一种权利要求1或2所述的菌群组合物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤s2中所述pcr扩增使用的引物包括正向引物338f和反向引物806r；所述正向引物338f的核苷酸序列如seq idno.1所示；所述反向引物806r的核苷酸序列如seq id no.2所示。

5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤s2中所述pcr扩增反应体系为：4μl5×fastpfu缓冲液，2μl2.5mm dntps，0.8μl 5μm正向引物，0.8μl 5μm反向引物，0.4μlfastpfu聚合酶，10ng总dna，0.2μl牛血清蛋白，h2o补足至总体积20μl。

6.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤s2中所述pcr扩增的程序为：循环95℃变性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。

7.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤s2中所述纯化回收采用磁珠纯化回收；所述定量检测采用荧光定量检测。

8.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤s3中所述对步骤s2得到的原始测序序列进行质控、拼接和过滤具体包括：采用fastqc软件对原始序列数据进行质量控制，通过usearch和vsearch软件获取引物的位置信息；采用dada2软件将测序获得的pereads拼接成一条序列，过滤低质量和重复的reads，去除嵌合体，修正扩增子的测序错误，最终得到优化序列。

9.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤s5中所述关键肠道菌群为乳酸杆菌属(lactobacillus)、杜氏乳杆菌属(dubosiella)、拟杆菌属(muribaculaceae)、毛螺菌属(lachnospiraceae)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)和粪杆菌属(faecalibaculum)。

10.一种预测肝纤维化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测权利要求1所述的菌群组合物。

技术总结
本发明公开了一种用于预测肝纤维化的肠道菌群组合物及其应用。所述菌群组合物包括以下六种菌属：乳酸杆菌属(Lactobacillus)、杜氏乳杆菌属(Dubosiella)、拟杆菌属(Muribaculaceae)、毛螺菌属(Lachnospiraceae)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和粪杆菌属(Faecalibaculum)。本发明采用16SrDNA测序技术检测肠道菌群，将健康人群与肝纤维化患者的肠道菌群检测结果对比，用关键菌群数据的升降，实现对肝纤维化的早期诊断和预测，为对患者制定进一步优化的干预策略提供参考价值，同时，可以在无创条件下进行检测，避免肝活检给患者机体造成损伤。

技术研发人员：袁君,刘赟,郑程,丁霄,朱传荣,熊清平,景怡
受保护的技术使用者：淮阴工学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15