一种提高细胞活力的营养液及其制备方法、应用与流程

本发明属于细胞培养，具体而言，涉及一种提高细胞活力的营养液及其制备方法、应用。

背景技术：

1、生物体的生理功能及一切生命现象都是以细胞为基本单位而表达的，任何生物现象无不来自细胞的功能，所以生物学的所有领域几乎都与细胞学有关。因此，不论对生物体的遗传、发育以及生理机能的了解，还是对于作为医疗基础的病理学、药理学等以及农业的育种等，对细胞的研究都至关重要。通常在进行生物学研究之前，细胞培养是最先进行的实验操作，虽然细胞培养技术非常基础，但对后续研究起到非常重要的支撑作用。在细胞培养中，细胞培养基是影响细胞生长及增殖的重要因素。

2、细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。细胞培养基包含细胞生长所需的各种营养物质，包括碳水化合物、氨基酸、无机盐、维生素等。针对不同细胞的营养需求，有多种合成培养基可供选择，如ebss、eagle、mem、rpmll640、dmem等。

3、间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。它们对骨髓中的造血干细胞（hsc）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如il-6，il-11，lif，m-csf及scf等）来支持造血。

4、细胞活力即在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比。研究发现，骨髓间充质干细胞在体外经10次以上的传代之后，细胞活力会大幅降低，导致增殖速度变慢，无法满足实际需求，如何提高骨髓间充质干细胞的活力成为了现在一个亟待解决的问题。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的技术问题，本申请提供了一种提高细胞活力的营养液，该营养液包含以下组分：绿原酸 20μg/ml～30μg/ml，阿魏酸 25μg/ml～35μg/ml，二甲双胍15μg/ml～25μg/ml， forskolin 10μg/ml～20μg/ml。

2、进一步地，该营养液包含以下组分：绿原酸 20μg/ml～25μg/ml，阿魏酸 25μg/ml～30μg/ml，二甲双胍 15μg/ml～20μg/ml， forskolin 15μg/ml～20μg/ml。

3、进一步地，该营养液包含以下组分：绿原酸 25μg/ml，阿魏酸 30μg/ml，二甲双胍20μg/ml， forskolin 15μg/ml。

4、本发明还提供了一种提高细胞活力的营养液的制备方法，其包括以下步骤：

5、称取适量绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和 forskolin，加入ddh2o溶解，并调整ph至7.0～7.2，定容，再使用0.22μm过滤器过滤，即可使用。

6、本发明还提供了一种提高细胞活力的营养液在培养骨髓间充质干细胞中的应用。

7、进一步地，所述应用包含以下步骤：

8、1）将营养液加入细胞培养基中，添加量为1～5%（v/v），得到复合培养液；

9、2）将骨髓间充质干细胞接种至步骤1）得到的复合培养液中，然后置于37℃、5%co2培养箱中传代培养，每隔2-3天换液一次，更换的培养基为新鲜的复合培养液。

10、进一步地，所述骨髓间充质干细胞是冷冻保存后经复苏得到的或分离得到的。

11、进一步地，所述细胞培养基包括但不限于dmem、rpmi 1640、mem、dmem/f12。

12、进一步地，所述营养液的添加量为5%（v/v）。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

14、绿原酸及其衍生物具有明显的自由基清除效果，可有效清除dpph自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基，还可抑制低密度脂蛋白的氧化。绿原酸对有效地清除体内自由基、维持机体细胞正常的结构和功能、防止和延缓肿瘤突变和衰老等现象的发生具有重要作用。杜仲绿原酸含有一种可促进人体的皮肤、骨骼、肌肉中胶蛋白的合成与分解的特殊成分，具有促进代谢、防止衰退的功能，可用来预防宇航员因太空失重而引起的骨骼和肌肉衰退，同时发现杜仲绿原酸无论在体内还是体外，均有明显抗自由基作用。

15、有研究阿魏酸能消灭自由基，恢复生命体的正常机能，阿魏酸可使生命体产生自由基的酶受到抑制，在此基础上，还可使清除自由基的酶增加。同时阿魏酸能时大大增强还原酶、谷化甘化转硫酶的活性，控制活性酪氨酸酶的比例。研究表明阿魏酸的抗氧化作用显著，对过氧化氨、超氧自由基、羟自由基、过氧化硝基等都有良好的清除效果。

16、本申请的营养液包含绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和forskolin，绿原酸、阿魏酸广泛来源于金银花、杜仲等植物，造价便宜，将其添加至细胞培养基中用于培养骨髓间充质干细胞时，传代15次之后，添加有营养液的实验组的细胞存活率仍可达到90%以上，比未添加营养液的空白组高出10.3%，传代20次后，实验组的细胞存活率比空白组高出22.9%，说明该营养液能够有效提高骨髓间充质干细胞在体外培养时的细胞活力，且经细胞毒性试验证明，本发明的营养液不会影响骨髓间充质干细胞的后续分化，无毒副影响，可有效改善骨髓间充质干细胞在体外经10次以上的传代之后细胞活力会大幅降低的问题，为骨髓间充质干细胞的体外培养提供了新思路。

技术特征：

1.一种提高细胞活力的营养液，其特征在于，所述营养液包含以下组分：绿原酸 20μg/ml～30μg/ml，阿魏酸 25μg/ml～35μg/ml，二甲双胍 15μg/ml～25μg/ml， forskolin 10μg/ml～20μg/ml。

2.如权利要求1所述的提高细胞活力的营养液，其特征在于，所述营养液包含以下组分：绿原酸 20μg/ml～25μg/ml，阿魏酸 25μg/ml～30μg/ml，二甲双胍 15μg/ml～20μg/ml，forskolin 15μg/ml～20μg/ml。

3.如权利要求1或2所述的提高细胞活力的营养液，其特征在于，所述营养液包含以下组分：绿原酸 25μg/ml，阿魏酸 30μg/ml，二甲双胍 20μg/ml， forskolin 15μg/ml。

4.如权利要求1～3任一所述的提高细胞活力的营养液的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

5.如权利要求1～3任一所述的提高细胞活力的营养液在培养骨髓间充质干细胞中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包含以下步骤：

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞是冷冻保存后经复苏得到的或分离得到的。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞培养基包括但不限于dmem、rpmi1640、mem、dmem/f12。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述营养液的添加量为体积比5%。

技术总结
本发明公开了一种提高细胞活力的营养液及其制备方法、应用，属于细胞培养技术领域。营养液包含绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和forskolin，将其添加至细胞培养基中用于培养骨髓间充质干细胞时，传代15次之后，细胞存活率仍可达到90%以上，说明该营养液能够有效提高骨髓间充质干细胞在体外培养时的细胞活力，且该营养液不会影响骨髓间充质干细胞的后续分化能力，没有毒副影响，可有效改善骨髓间充质干细胞在体外经10次以上的传代之后细胞活力会大幅降低的问题。

技术研发人员：田大禹
受保护的技术使用者：成都高新绮澳医疗美容诊所有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14