一种MHC-peptide复合物分离方法及应用与流程

本发明涉及肽段分离，尤其涉及一种mhc-peptide复合物分离方法及应用。

背景技术：

1、免疫肽是细胞通过细胞表面的主要组织相容性复合物(mhc)递呈的肽段，细胞表面主要有两种mhc，mhc-i型和mhc-ii型，两种mhc在与免疫肽结合区域的结构存在较大差异，导致mhc-i/ii结合的免疫肽的特征有所不同。mhc-i型免疫肽长度通常以8-12为主，长度较短，氨基酸组成多不带有碱性氨基酸，从而导致免疫肽在质谱中的离子化效率较差；mhc-ii型免疫肽长度通常以13-17为主，长度较长，肽段疏水性相较mhc-i型高。

2、目前检测mhc-i/ii型免疫肽的主要方法是用mhc-i/ii抗体对复合物进行富集，复合物富集的过程中将肽段同时捕获，随后分离mhc-i/ii蛋白与免疫肽，获取免疫肽后用高分辨液质连用设备检测，结合同源比对和重头测序的技术对质谱数据进行解析，获取免疫肽列表。在这个过程中，将mhc-i/ii与免疫肽有效分离对于后续免疫肽的检测非常关键，现在常用的分离方法是同反相材料，例如c18，利用蛋白、肽段的疏水性先将它们保留，通过肽段、蛋白在反相上的保留性质的不同对它们进行分离，该方法缺点主要有两个：一是需要较多的反相的材料，为了最大程度结合蛋白和免疫肽，需要用到10-50mg的反相材料，造成实验材料的浪费；二是低有机相比例的洗脱方式对于疏水性强的免疫肽具有限制性，从而导致免疫肽损失。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了有鉴于此，本发明提出了一种mhc-peptide复合物分离方法及应用，该方法可以利用少量ram材料实现蛋白与肽段的分离，同时，肽段的洗脱使用高比例有机相结合盐的洗脱方式有效解决低比例有机相对疏水性肽段洗脱的限制。

2、本发明的技术方案是这样实现的：一方面，本发明提供了一种mhc-peptide复合物分离方法，包括如下步骤：

3、s1，制备ram小柱：用筛板堵住枪头，取ram材料置于筛板上，然后离心压实；

4、s2，ram小柱活化：加入乙酸铵离心活化；

5、s3，样本制备：取mhc-peptides复合物干粉用乙酸铵复溶，离心后取上清备用；

6、s4，上样：将步骤s3步制备好的样本加入到步骤s2活化好的ram小柱上，离心后接流穿液；

7、s5，重复上样：将步骤s4的流穿液加入ram小柱，重复步骤s4操作1次；

8、s6，清洗：加入乙酸铵，离心后弃流穿，重复清洗操作4次；

9、s7，洗脱：加入乙腈乙酸铵溶液，离心后收集留穿液，重复洗脱操作1次，合并两次流穿液，用离心浓缩仪吹干成肽段干粉；

10、s8，步骤s7的肽段干粉用甲酸复溶后，采用lc-msms仪检测。

11、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s1的枪头规格为200μl，ram材料用量为8-15mg，离心条件为：800-1000rcf离心1-2min。

12、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s2和s6的乙酸铵的用量为200μl，浓度为10-20mmol/l，离心条件为：800-1000rcf离心1-2min。

13、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s3的mhc-peptides复合物干粉用量为10-20μg，乙酸铵的用量为100μl，浓度为10-20mmol/l，离心条件为：10000-14000rcf离心3-5min。

14、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s4中，离心条件为800-1000离心1-2min。

15、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s7中，乙腈乙酸铵溶液用量为200μl，乙腈的体积百分数为60-80％，乙酸铵浓度为10-20mmol/l，离心条件为：800-1000rcf离心1-2min。

16、在以上技术方案的基础上，优选的，所述mhc-peptides复合物干粉的制备方法为：mhc-i/ii阳性细胞加入裂解缓冲液中，冰上孵育1-2min，超声3-5min，10000-14000rcf离心3-5min，收集上清液，经抗体富集和酸洗脱后用离心浓缩仪吹干成mhc-peptides复合物干粉。

17、在以上技术方案的基础上，优选的，所述裂解液为8-10mol/l尿素和0.1-0.3mol/ltris-hcl缓冲液的混合液

18、另一方面，本发明提供了一种mhc-peptide复合物分离方法在分离mhc-i/ii复合物和肽段中的应用。

19、本发明的一种mhc-peptide复合物分离方法及应用相对于现有技术具有以下有益效果：

20、(1)本发明所用的限进性材料(ram)是亲水性质球面(见图1)，其表面分布有小孔，小孔内部具有疏水性质，可结合多肽，特殊的结构使ram材料同时具备尺寸排阻和反相的特性。分离时，复合物中肽段体积能与材料表面小孔结合从而保留，蛋白因为体积大排除在小孔外，不在小孔中保留从而利用少量ram材料实现蛋白与肽段的分离。本发明提供的ram材料能有效改善mhc-i疏水性肽段的覆盖，减少反相材料分离导致的疏水性高肽段的损失，减少了保留过程中的污染。

21、(2)本发明肽段的洗脱使用高比例有机相结合盐的洗脱方式有效解决低比例有机相对疏水性肽段洗脱的限制。

技术特征：

1.一种mhc-peptide复合物分离方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的一种mhc-peptide复合物分离方法，其特征在于：步骤s1的枪头规格为200μl，ram材料用量为8-15mg，离心条件为：800-1000rcf离心1-2min。

3.如权利要求1所述的一种mhc-peptide复合物分离方法，其特征在于：步骤s2和s6的乙酸铵的用量为200μl，浓度为10-20mmol/l，离心条件为：800-1000rcf离心1-2min。

4.如权利要求1所述的一种mhc-peptide复合物分离方法，其特征在于：步骤s3的mhc-peptides复合物干粉用量为10-20μg，乙酸铵的用量为100μl，浓度为10-20mmol/l，离心条件为：10000-14000rcf离心3-5min。

5.如权利要求1所述的一种mhc-peptide复合物分离方法，其特征在于：步骤s4中，离心条件为800-1000离心1-2min。

6.如权利要求1所述的一种mhc-peptide复合物分离方法，其特征在于：步骤s7中，乙腈乙酸铵溶液用量为200μl，乙腈的体积百分数为60-80％，乙酸铵浓度为10-20mmol/l，离心条件为：800-1000rcf离心1-2min。

7.如权利要求1所述的一种mhc-peptide复合物分离方法，其特征在于：所述mhc-peptides复合物干粉的制备方法为：mhc-i/ii阳性细胞加入裂解缓冲液中，冰上孵育1-2min，超声3-5min，10000-14000rcf离心3-5min，收集上清液，经抗体富集和酸洗脱后用离心浓缩仪吹干成mhc-peptides复合物干粉。

8.如权利要求7所述的一种mhc-peptide复合物分离方法，其特征在于：所述裂解液为8-10mol/l尿素和0.1-0.3mol/ltris-hcl缓冲液的混合液。

9.如权利要求1-8任一所述的一种mhc-peptide复合物分离方法在分离mhc-i/ii复合物和肽段中的应用。

技术总结
本发明提出了一种MHC‑peptide复合物分离方法及应用，该方法包括以下步骤：制备RAM小柱，乙酸铵活化RAM小柱，MHC‑peptides复合物样本制备，上样，乙酸铵反复清洗RAM小柱，乙腈乙酸铵溶液洗脱，流穿液用离心浓缩仪吹干成肽段干粉，并用液质连用方法对免疫肽进行检测。本发明提供的RAM材料能有效改善MHC‑I疏水性肽段的覆盖，减少反相材料分离导致的疏水性高肽段的损失，减少了保留过程中的污染。

技术研发人员：彭超,吴萍,苗豪菲
受保护的技术使用者：百蓁生物科技（上海）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15