一种荧光探针和制备方法、便携式检测乙酰胆碱酯酶的方法

本发明属于乙酰胆碱酯酶检测的，尤其涉及一种荧光探针和制备方法、便携式检测乙酰胆碱酯酶的方法。

背景技术：

1、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，ache)具有羧肽酶和氨肽酶的活性，对动物神经传导过程起着重要的作用，它主要的生理功能是水解乙酰胆碱(atch)，生成乙酸和胆碱(tch)，将神经系统内ache含量控制在合理范围内，从而使得神经冲动传递受到阻碍，促进神经元发育和神经再生。研究表明，ache可加速淀粉样蛋白β肽异常聚集，形成中枢神经系统中的阿尔茨海默氏淀粉样蛋白纤维，从而诱导阿尔兹海默症。此外，抑郁症中的异常情绪波动也可能受到ache活动的影响。因此，了解ache活性的变化对于深入分析这些神经系统疾病的分子机制至关重要。然而，目前尚不清楚这些疾病中ache活性的动态调节机制。为了更深入地了解ache在这些疾病中的作用，开发一种用于在体外监测乙酰胆碱酯酶的实时工具显得尤为重要。

2、传统的ache检测方法通常采用高效液相色谱法、气相色谱法和质谱法等常规色谱技术进行。但这些方法有前处理过程繁琐、分析时间长、仪器及药品成本高等不足。因此，建立简单、快速且灵敏度高的ache检测方法逐渐成为研究重点。现有的ache检测方法多使用大型仪器作为荧光的探测器，一方面较为笨重不易携带，另一方面检测不够简单快速，不利于对现场ache的检测。因此，如何提供一种高灵敏度、高选择性的现场检测ache的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、针对乙酰胆碱酯酶现场检测工艺复杂的技术问题，本发明提出一种荧光探针和制备方法、便携式检测乙酰胆碱酯酶的方法，该方案可以使用手机和便携式设备代替大型仪器作为荧光的探测器，检测方法更加简单、便携、灵敏，便于现场对ache进行检测。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种荧光探针，所述荧光探针的结构为：

4、

5、荧光探针的制备方法，其特征在于，合成路线如下式：

6、

7、其步骤为：将lss-oh、丙酰氯、碱性催化剂和溶剂混合制得反应液，经反应制得荧光探针lss-ache。

8、所述lss-oh、丙酰氯和碱的摩尔比为1：(1～5)：(1～3)。

9、所述反应液中lss-oh的浓度为0.05～0.1mmol/ml。

10、所述碱性催化剂为三乙胺、吡啶或n,n-二异丙基乙胺中的任一种。

11、所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、异丙胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醚和石油醚中的任一种。

12、所述反应的条件为：时间为8～24h、温度为20℃～30℃。

13、所述制备方法还包括对反应后的反应液进行纯化，所述纯化选自：柱层析法、重结晶法、打浆法和薄层色谱法中的一种。

14、一种便携式检测乙酰胆碱酯酶的方法，采用权利要求1所述荧光探针检测乙酰胆碱酯酶，包括以下步骤：

15、步骤一、将琼脂糖、荧光探针和tris-hcl缓冲液混合制得目标响应水凝胶；

16、步骤二、制备n份不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液，其中，n≥2；

17、步骤三、将n份不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液分别与目标响应水凝胶反应，在紫外线照射条件获得每份待检测标准溶液彩色图像，对彩色图像进行分析获得rgb值，建立强度比值g/r+b与乙酰胆碱酯酶浓度之间的线性关系式。

18、所述步骤一中将琼脂糖和荧光探针溶于水配制荧光探针溶液和琼脂糖溶液，再与琼脂糖和tris-hcl缓冲液混合，琼脂糖溶液、荧光探针溶液和tris-hcl缓冲液的体积比为(1～2)：(1～4)：(1～2)。

19、琼脂糖溶液的浓度为4～5mm；所述荧光探针溶液的浓度为5～10μm；tris-hcl缓冲液的浓度为50mm，ph＝7.5。

20、所述步骤二中5≤n≤10，n份乙酰胆碱酯酶标准溶液的浓度递增，初始浓度为0，相邻两份之间乙酰胆碱酯酶标准溶液的浓度差值为1～10mu/ml。

21、本发明的有益效果：本发明中设计并合成了一种新的基于茚-查尔酮的荧光探针lss-ache，lss-ache在505nm处没有荧光发射，遇到ache后，其分子内的酯键被水解断裂，在505nm处有强的荧光发射。lss-ache对ache具有高选择性和敏感性(lod＝0.0097mu/ml)，良好的水溶性和具有大的斯托克斯位移(105nm)。并且以水凝胶为载体，与智能手机构建便携式智能检测平台，实现了对ache的现场即时检测。

22、该方案可以使用手机和便携式设备代替大型仪器作为荧光的探测器，检测方法更加简单、便携、灵敏，便于现场对ache进行检测。

技术特征：

1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构为：

2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，合成路线如下式：

3.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述lss-oh、丙酰氯和碱的摩尔比为1：(1～5)：(1～3)。

4.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述碱性催化剂为三乙胺、吡啶或n,n-二异丙基乙胺中的任一种。

5.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、异丙胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醚和石油醚中的任一种。

6.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述反应的条件为：时间为8～24h、温度为20℃～30℃。

7.一种便携式检测乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于，采用权利要求1所述荧光探针检测乙酰胆碱酯酶，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的便携式检测乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于，所述步骤一中将琼脂糖和荧光探针溶于水配制荧光探针溶液和琼脂糖溶液，再与琼脂糖和tris-hcl缓冲液混合，琼脂糖溶液、荧光探针溶液和tris-hcl缓冲液的体积比为(1～2)：(1～4)：(1～2)。

9.根据权利要求8所述的便携式检测乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于，琼脂糖溶液的浓度为4～5mm；所述荧光探针溶液的浓度为5～10μm；tris-hcl缓冲液的浓度为50mm，ph＝7.5。

10.根据权利要求7所述的便携式检测乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于，所述步骤二中5≤n≤10，n份乙酰胆碱酯酶标准溶液的浓度递增，初始浓度为0，相邻两份之间乙酰胆碱酯酶标准溶液的浓度差值为1～10mu/ml。

技术总结
本发明提出了一种荧光探针和制备方法、便携式检测乙酰胆碱酯酶的方法，属于乙酰胆碱酯酶检测的技术领域，用以解决乙酰胆碱酯酶现场检测工艺复杂、灵敏度和选择性低的技术问题。本发明探针材料的结构式为：探针LSS‑AChE基于酯基的催化水解识别乙酰胆碱酯酶(AChE)，释放出显著的绿色荧光。所述LSS‑AChE对AChE具有高选择性和敏感性(LOD＝0.0097mU/mL)，良好的水溶性和具有大的斯托克斯位移(105nm)。并以壳聚糖水凝胶为载体与智能手机结合构建了便携式检测平台，实现了对AChE现场即时检测。

技术研发人员：薛灵伟,申奥,李青彬
受保护的技术使用者：平顶山学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15