一种鉴定长江流域长颌鲚和短颌鲚的SNP位点和方法

本发明涉及分子生物学、基因组学的领域，具体为通过snp标记位点的多态性，分析鉴定刀鲚类型，区分长颌鲚和短颌鲚个体。

背景技术：

1、刀鲚隶属鲱形目、鳀科、鲚属是长江流域重要的洄游性鱼类。每年春季，刀鲚的性成熟个体将长江河口水域沿江上溯，洄游至长江附属的淡水湖泊进行产卵。当年孵化出的幼鱼顺江而下，暂栖于海口附近咸淡水中，次年入海以完成生长及育肥。刀鲚其味道鲜美，与鲥鱼、暗纹东方鲀并称为“长江三鲜”，深受人民喜爱。但近年来，由于人为捕捞，水利工程的兴建以及环境污染等导致的刀鲚生殖环境被破坏，其野生资源遭到了极大破坏，资源量严重锐减。

2、传统分类上按照刀鲚的表型和生态型将其分为上颌长大于头长(上颌长/头长大于1)属于长颌鲚；上颌长小于头长(上颌长/头长小于1)，定居淡水湖泊和河流的短颌鲚。二者由于生活史有部分重叠，诸多的可量性状都存在相似，因此长颌鲚、短颌鲚之间的分类地位和区分方法，一直存在争议。两种类型的刀鲚中长颌鲚价值最高，但因酷渔滥补，其野生资源量骤减；而短颌鲚的资源量较大，经济价值较低。刀鲚种群的正确区分对鱼类资源的针对性保护和利用将有着极为重要的意义。

3、传统研究中一般采用测量颌长头长之比的方法对长颌鲚和短颌鲚进行区分。这种方式会受到样品保存状况，测量误差，比值趋近等因素影响。因此，需要开发一种新的鉴定方式，通过比对长颌鲚、短颌鲚基因组上的多态性差异，筛选特定区域的分子标记对长颌鲚、短颌鲚进行鉴定。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种通过snp标记鉴定长颌鲚和短颌鲚的方法。

2、本发明另一个目的在于提供检测上述snp标记的引物。

3、一种用于鉴定长江流域长颌鲚与短颌鲚的引物组合，选自以下引物对中的任意一个或者多个：

4、引物对m，其上下游序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示：

5、seq id no.1(f-m)gtgacgtcagcggcctggt

6、seq id no.2(r-m)ttgaggtgtgtgacggacgg；

7、引物对p，其上下游序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示：

8、seq id no.3(f-p)gtcgctatatggcccatcacc

9、seq id no.4(r-p)tgtgaaactttagccataacg

10、引物对n，其上下游序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示：

11、seq id no.5(f-n)aggacgctgagaccatctttg

12、seq id no.6(r-n)ggatctcatcgtagccatca。

13、以刀鲚组织dna为模板进行扩增，n、p和m引物对的扩增产物长度分别为330bp、283bp和335bp。

14、一种用于鉴定长江流域长颌鲚与短颌鲚的试剂盒，包括如上述引物对的任意一种或多种。

15、上述引物组合及试剂盒可用于鉴别长江流域长颌鲚与短颌鲚。

16、本发明的另一个技术方案为：

17、一种用于鉴定长江流域长颌鲚与短颌鲚的snp位点组合，包括以下位点中的至少一个：

18、(1)引物对m扩增产物的第64位；其多态性为g/a；

19、(2)引物对m扩增产物的第180位；其多态性为g/a；

20、(3)引物对m扩增产物的第282位；其多态性为c/t；

21、(4)引物对p扩增产物的第107位；其多态性为a/g；

22、(5)引物对n扩增产物的第67位；其多态性为c/t；

23、(6)引物对n扩增产物的第229位；其多态性为a/t；

24、所述引物对m的上下游序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示；

25、所述引物对p的上下游序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示；

26、所述引物对n的上下游序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示。

27、一种鉴定长江流域长颌鲚与短颌鲚的方法，步骤包括：

28、(1)提取刀鲚样本dna，采用引物对m、引物对p、引物对n中的任意一个或者其任意组合进行扩增和测序；

29、(2)分析扩增产物序列中snp标记的碱基，判断刀鲚样本为长颌鲚或短颌鲚。

30、具体的，步骤(2)中判断方法为，长颌鲚的snp标记的碱基至少符合以下情况中的一种：引物对m扩增产物第64位为g、第180位为g、第282位为c；引物对p扩增产物第107位为a；引物对n扩增产物第67和229位分别为c和a；

31、短颌鲚的snp标记的碱基至少符合以下情况中的一种：引物对m扩增产物第64位为a、第180位为a、第282位为t；p引物对扩增产物第107位为g；n引物对扩增产物第67位、第229位为t。

32、步骤(1)的扩增条件为：93-96℃预变性4-8min，93-96℃℃变性20-40s，53-60℃退火20-40s，71-73℃延伸20-40s；循环30-60次；循环结束后，71-73℃终延伸8-15min。

33、采用引物对m或引物对p时，退火温度为53-56℃，优选为55℃；采用引物对n时，退火温度为57-59℃，优选为58℃。

34、本发明的优选方案为：95℃预变性5min；95℃变性30s；采用引物对m或引物对p时，55℃退火30s，采用引物对n时，58℃退火30s 72℃延伸30s，进行40次循环。循环结束后，72℃终延伸10min。

35、本发明针对目前刀鲚群体种之间鉴定的缺陷和不足，提供了通过snp标记对长颌鲚和短颌鲚进行鉴别的方法，获得了3个主要序列的6个snp位点，这6个snp在长颌鲚和短颌鲚之间存在显著差异，可以从分子层面对刀鲚类型进行有效分类。并设计引物进行扩增，所获得的扩增产物经过测序，能够根据snp位点的碱基类型，对长颌鲚和短颌鲚进行鉴别。

36、采用本发明方案，通过对组织dna提取、pcr扩增和测序，随后对测序结果进行对比就能快速准确地鉴别长颌鲚、短颌刀鲚类型。该方法操作简便、处理时间短且准确率高，适合不同实验环境需要。

技术特征：

1.一种鉴定长江流域长颌鲚与短颌鲚的引物组合，其特征在于，选自以下引物对中的任意一个或者多个：

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，

3.一种鉴定长江流域长颌鲚与短颌鲚的snp位点，其特征在于，选自以下位点中的任意一个：

4.一种鉴定长江流域长颌鲚与短颌鲚的方法，其特征在于，步骤包括：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中判断方法为，长颌鲚的snp标记的碱基至少符合以下情况中的一种：m引物对扩增产物第64位为g、第180位为g、第282位为c；p引物对扩增产物第107位为a；n引物对扩增产物第67和229位分别为c和a；

6.一种鉴定长江流域长颌鲚与短颌鲚的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组合。

7.权利要求1或2所述的引物组合或者权利要求6所述的试剂盒在鉴定长江流域长颌鲚与短颌鲚方面的应用。

技术总结
本发明为一种鉴定长江流域长颌鲚和短颌鲚的SNP位点和方法，涉及分子生物学、基因组学的领域，具体公开了用于鉴别长江流域长颌鲚与短颌鲚的引物组合及其扩增产物中的SNP位点组合。并公开了一种鉴别长颌鲚和短颌鲚的方法，包括以下步骤：(1)提取刀鲚样本DNA，采用上述引物组合中的任意一个或者多个引物对进行扩增；(2)分析扩增产物序列SNP标记的碱基，判断刀鲚样本为长颌鲚或短颌鲚。本发明获得了3个主要序列的6个SNP位点，这6个SNP在长颌鲚和短颌鲚之间存在显著差异，可以从分子层面对刀鲚类型进行有效分类，通过对组织DNA提取、PCR扩增和测序，就能快速准确地鉴别长颌鲚、短颌刀鲚类型。该方法操作简便、处理时间短且准确率高，适合不同实验环境需要。

技术研发人员：韩爽,陈良标,卢玉平,王洁,刘其根,林泰兴,涂翰卿,倪满
受保护的技术使用者：上海海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15