一种分选体液中外泌体的驻波声流控器件及其使用方法

本发明涉及微流控技术与生物颗粒处理，具体涉及一种分选体液中外泌体的驻波声流控器件及其使用方法。

背景技术：

1、高效的颗粒分离方法与技术对特定细胞检测、药物筛选及组织工程等生物化学分析过程具有重要意义。微流控是在微米或亚微米尺度下对颗粒和流体进行操控的新兴科学技术。微流控芯片是微流控技术的重要载体，具有低能耗、可连续操作、微型、集成化程度高等优势，可实现大型、多功能生化分析实验室的主要功能。近年来，基于微流控芯片的细胞、细菌及外泌体等生物颗粒分选器件不断涌现，采用的方法主要包括离心法、流体动力学法、介电泳法、基于电磁场的分离方法等。这些方法由于会对细胞的活性造成影响，所需要的微流控芯片（通道芯片）结构复杂，操作灵活性差及需要大型设备等原因，在微纳颗粒分选领域的应用受到较大的限制。

2、基于声场的微流控分离方法通过声辐射力与声学流控制颗粒在流体中的运动，具有非接触、高效、所需设备简单、操纵灵活、可控性高等优势，在细胞、外泌体等微纳颗粒的分选领域具有极大的应用前景。目前基于声场的微流控分选装置主要有两种，一种是基于压电单晶如铌酸锂（linbo3）、钽酸锂（litao3）等产生声表面波形成驻波声场，直接与通道中的待分选样本进行耦合；一种是使用压电陶瓷如锆钛酸铅压电陶瓷(pzt）等产生纵波，通过分选通道对声波的反射形成驻波声场，与待分选样本耦合完成分选。基于压电单晶的声流控分选装置极易受温度等的影响，分选过程不稳定，且所采用的叉指换能器制造过程繁琐、调控难度大，限制了其推广应用。目前基于pzt的声流控分选器件，依赖于通道宽度、深度等与声波半波长的匹配，对声波频率产生了较大限制，对分选通道的制造精度提出了较高要求，且声场形式单一、声场分布局限于与通道形状相同，分选效率较低，同样限制了其推广使用。此外，目前的基于声场的微流控分选装置主要以聚二甲基硅氧烷（pdms）、硅（si）微流控芯片为主，与压电基底多为不可逆连接，难以满足生物样本处理的一次性使用需求。因此，如何稳定、快速、便捷的获得所需要声场及实现分选微流控芯片与换能器的可拆卸式连接是微流控分选装置的重要开发方向。

3、基于此，有必要设计一种不会对细胞活性造成影响、不受温度等的影响、分选过程稳定、制造过程简单、调控难度小以及不用依赖于微流控通道宽度、深度等与声波半波长的匹配的分选体液外泌体的微流控器件。

技术实现思路

1、鉴于目前存在的上述不足，本发明提供一种分选体液中外泌体的驻波声流控器件及其使用方法，具有不会对细胞活性造成影响、不受温度等的影响、分选过程稳定、制造过程简单、调控难度小以及不用依赖于微流控通道宽度、深度等与声波半波长的匹配等优点。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种分选体液中外泌体的驻波声流控器件，包括上层的微流控芯片和下层的声波激发装置，所述微流控芯片包括通道芯片和盖片，所述声波激发装置包括压电换能器和声波耦合液层；所述压电换能器与所述盖片通过声波耦合液层进行可逆连接；所述压电换能器为压电陶瓷，所述通道芯片上设有分选通道，所述分选通道上包括体液分选通道，所述盖片上设有与所述体液分选通道对应的微通道槽阵列结构，所述微通道槽阵列结构调节压电换能器激发的声波使其在通道芯片和盖片组成的空间内调制形成所需的驻波声场；

3、需要说明的是，针对现有的基于声场的微流控分选通道芯片存在的易受温度影响、插指电极制造过程复杂、通道芯片制造精度要求高、难度大及不适合一次性使用的缺点，本发明采用较为常规的、稳定性高的pzt压电换能器作为声波激发装置，通过带有微通道槽阵列结构的盖片对声波的波前进行调制，在通道芯片的体液分选通道内部获得所需要的驻波声场。

4、需要说明的是，盖片将声场调制模块（微通道槽阵列结构）与压电换能器分离开，从而实现了分选通道的一次性使用。

5、所述分选通道位于所述通道芯片的内表面，包括鞘流入口、鞘流流道、分流流道、第一鞘流通道、体液入口、体液通道、第二鞘流通道、体液分选通道、细胞通道、细胞出口、外泌体通道和外泌体出口；所述鞘流入口通过所述鞘流流道与所述分流流道实现鞘流的分流；所述分流流道的两端分别与所述第一鞘流通道和所述第二鞘流通道连通；所述体液入口与所述体液通道连通，所述体液通道、第一鞘流通道和第二鞘流通道在其出口端相连通，且与所述体液分选通道的入口端连通；所述体液分选通道的出口端在所述第一鞘流通道的一侧通过细胞通道与细胞出口连通；所述体液分选通道的出口端在所述第二鞘流通道的一侧通过外泌体通道与外泌体出口连通；

6、需要说明的是，在通道芯片内部，通过两侧的鞘流聚焦作用，将含有待分选样本的样本流固定在体液分选通道的中间，通过声场与流场的耦合作用，实现体液中细胞和外泌体的分离。

7、所述通道芯片上还贯穿设有鞘流口、体液进样口、细胞收集口和外泌体收集口；所述鞘流口、体液进样口、细胞收集口和外泌体收集口分别依次分别与所述分选通道上的鞘流入口、体液入口、外泌体出口、细胞出口贯通；所述鞘流口与所述体液进样口分别与外接进样装置连接；所述细胞收集口和外泌体收集口分别与外接收集装置连接。

8、依照本发明的一个方面，所述盖片含有微通道槽阵列的一侧与所述通道芯片含有分选通道的一侧键合；所述微通道槽阵列分布在所述体液分选通道所在的区域内；所述微通道槽阵列中的微通道槽的截面形状为矩形或梯形，微通道槽的截面宽度w=20-100μm，微通道槽的截面深度h=30-80μm，当微通道槽的截面形状为梯形时，微通道槽的截面倾斜角θ=10-35°，微通道槽的延伸方向平行长方形盖片的长边，微通道槽阵列/体液分选通道与微通道槽的夹角β=10-25°。

9、需要说明的是，如图5所示，通过盖片上的微通道槽阵列对声波波前进行调控时，采用截面形状为矩形或者梯形的微通道槽，矩形或者梯形的微通道槽在盖片与体液分选通道接触的区域形成微脊。依据瑞丽波与液体表面接触时通过漏波的形式在液体内部形成驻波声场的原理，瑞丽波的波峰与波谷为相应的相位超前及滞后区域，在液体内部形成高压区，波峰与波谷间存在相位相对为零的低压区，高、低压区相间分布形成二维驻波声场。通过微脊和微通道槽模拟瑞丽波的波峰和波谷，一个重复单元中微脊和微通道的宽度总和2w相当于瑞丽波的波长，其大小根据分选通道总宽度及待分选体液所含待分选颗粒尺寸而定，在待分选液体区域内部同一高度处形成声波超前相位、零相位及滞后相位相间分布的模式，形成相对应的高、低压区相间分布的驻波声场，利用声波在固体盖片和液体中传播速度的不同，通过微通道的深度h、倾角θ（梯形截面）调控相位差，实现微通道结构与激发声波频率的匹配。该种声场调制方式不需要依赖分选通道的尺寸精度。

10、依照本发明的一个方面，所述压电陶瓷为锆钛酸铅压电陶瓷。

11、依照本发明的一个方面，所述盖片上设有第一定位块和第二定位块；所述通道芯片上设有第一定位孔和第二定位孔；所述第一定位块和所述第二定位块分别与第一定位孔和第二定位孔适配。

12、依照本发明的一个方面，所述体液分选通道的截面呈矩形，宽度为600-1200μm，深度为80-150μm；所述第一鞘流通道与所述体液通道的出口端之间的夹角为30-60°；所述第二鞘流通道与所述体液通道的出口端之间的夹角为30-60°；所述外泌体通道与所述细胞通道的入口端之间的夹角为60-120°。

13、需要说明的是，通过在各通道聚焦处设置夹角，聚焦鞘流会对待分选样本流形成一定的挤压，使样本流保持在通道中间运动，同时鞘流会沿着通道向分离口运动。通过在各通道分离口处设置夹角，可以使样本流道与分离流道中流体流线形成一定的角度，更利于流体分选。

14、依照本发明的一个方面，所述通道芯片和所述盖片的材料相同，为聚甲基丙烯酸甲酯或环烯烃类共聚物；所述通道芯片和所述盖片通过注塑成型和模内热压键合的方式一体化成型。

15、需要说明的是，微流控分选通道芯片与盖片通过注塑成型及模内热压键合工艺一体化成型，pzt压电换能器与盖片间通过声波耦合液进行可逆连接，实现pzt换能器的重复利用及微流控分选通道芯片的一次性使用。

16、依照本发明的一个方面，所述声波耦合液层的厚度为100-300μm。

17、基于同一发明构思，本发明还提供了上述分选体液中外泌体的驻波声流控器件的使用方法，包括以下步骤：

18、步骤1：配置鞘流溶液；准备体液样本溶液；其中，所述鞘流溶液为磷酸盐缓冲溶液、生理盐水中的任意一种，但不限于此；所述体液样本溶液为血浆、肺泡灌洗液中的一种，但不限于此；

19、步骤2：对分选体液中外泌体的驻波声流控器件的分选通道进行清洗；

20、步骤3：通过微注射泵从所述鞘流口注入步骤1的鞘流溶液，通过另一微注射泵在所述体液进样口注入步骤1的体液样本溶液；控制鞘流溶液和体液样本溶液在所述体液分选通道的流速，使得体液样本溶液在所述体液分选通道的中间；

21、步骤4：对压电换能器施加正弦交流信号，使得体液分选通道产生驻波声场，从而在外泌体出口和细胞出口分别收集到外泌体和细胞，实现体液中细胞和外泌体的分选。

22、依照本发明的一个方面，在步骤1中，所述鞘流溶液包括磷酸盐缓冲溶液、生理盐水中的任意一种；在步骤2中，清洗具体为先使用无水乙醇清洗，再使用鞘流溶液清洗。

23、依照本发明的一个方面，在步骤3中，所述体液样本溶液的流速为0.5-20μl/min，所述鞘流溶液和所述体液样本溶液的流速比大于等于3︰1。

24、本发明的体液中外泌体的分选原理：

25、采用微注射泵将鞘流溶液通过聚乙烯软管注入鞘流口，通过分流流道分别进入到第一、二鞘流通道，与待分选体液样本流在体液分选通道（直流通道）汇流，对待分选体液样本流形成挤压作用，期间控制两侧鞘流溶液与待分选样本的流速比大于等于3︰1，保证待分选体液样本被压缩在通道的中间，并保持pzt压电换能器通电，进行分选。待分选体液样本中的细胞或外泌体在驻波声场中会受到声辐射力的作用，所受声辐射力的大小与细胞或外泌体的体积正相关，即f=kd3，其中f为细胞或外泌体所受的声辐射力，k为与细胞或外泌体的密度、声场强度等相关的比例系数，d为细胞或外泌体的直径。待待分选体液样本中尺寸较大的细胞所受声辐射力较大，率先向垂直于流线的方向偏转，尺寸较小的外泌体所受声辐射力较小，在流场作用下其运动方向与流线作用方向基本保持一致，具体如图7所示。盖片上微通道槽的延伸方向与待分选体液样本的流动方向之间的夹角α保持在10-25°，在体液分选通道内部形成与体液样本流动方向倾斜分布的驻波声场，细胞或外泌体在流场与声辐射力的作用下流动时可跨越多个声压节点，使得细胞或外泌体在体液分选通道内部具有更大的横向位移，如图8所示，可大大提高分选的效率。经过在体液分选通道（直流通道）中的分选，细胞通过细胞通道及细胞出口流至细胞收集管，剩余的含有外泌体的样本从外泌体通道和外泌体出口流出，经回收瓶进行收集。

26、本发明的有益效果：

27、（1）本发明的驻波声流控体液样本外泌体分选器件性能更加稳定、结构简单、制造过程简便、使用过程简单，同时满足了生物化学样品处理的一次性使用及低成本需求，具有较高的分选效率，在生物外泌体分选领域具有广泛的应用前景。

28、（2）本发明的驻波声流控器件可同时受流场和声场参数共同控制，通过控制体液分选通道的声场、流场参数，可以实现待分选体液样本中细胞和外泌体的灵活、高效分选，提高分选通量与分选效率，具有良好的生物应用价值。

29、（3）本发明的驻波声流控器件通过在盖片的内表面调整微通道槽阵列的类型及尺寸，可有效改变分选通道中声场的分布及强度，大大减少了对换能器及通道芯片的制造要求及成本，有助于驻波声流控器件的推广和应用。

30、（4）本发明的驻波声流控器件的通道芯片和盖片通过注塑及模内键合技术一体化成型，作为耗材，成型后的微流控芯片和pzt压电换能器采用声波耦合液层进行可逆键合连接，适合生物样本等的一次性使用需求，pzt压电换能器作为能量转换装置，性能稳定，重复使用。通道芯片整体结构简单，制造工艺简便，成本较低。