一类具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌肽及其应用

本发明属于生物化学，涉及一类具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌肽，本发明同时还涉及该抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。

背景技术：

1、抗生素的发现为治疗传染类疾病以及预防手术后的感染带来了曙光。但是近些年来各种耐药性细菌层出不穷，而抗生素的发现却越来越缓慢，有些药物甚至还没上市就已经出现了耐药性变种，给世界经济和公共卫生等方面带来极大的挑战。抗菌肽作为宿主防御肽在自然界很多生物体内广泛存在。抗菌肽与作用于细菌细胞壁、蛋白质、核酸的生物合成或代谢功能途径的传统抗生素不同，其独特的破坏细菌生物膜的作用机制使其不易产生耐药性。

2、然而，天然抗菌肽的长序列、低功效、不稳定、高毒性等问题使其作为治疗药物的使用受到了限制，这阻碍了抗菌肽的开发和临床应用。α-螺旋和β-折叠是抗菌肽中常见的两个主要二级结构。α-螺旋很难在高活性和低毒性之间达到完美的平衡，使其选择性较低。β-发夹结构由两条平行链和一个β-转角组成，在细菌膜的条件下，疏水氨基酸或带正电荷的残基排列在片层的两侧，以形成类似于α-螺旋的两亲性结构使其具有高抗菌活性，较多的正电荷氨基酸使其在细菌和正常细胞之间的选择性增加。一些研究表明，在完美的α-螺旋中间掺入类似于β-转角的序列有利于降低其毒性(bobone et al.,2013；jin et al.,2005；ma et al.,2014；tripathi et al.,2017)，基于此，可以设计具有不同β-转角序列的对称型β-发卡抗菌肽，以期得到兼具高活性、低毒性且高稳定性的多肽类抗菌药物。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一类具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌肽。

2、本发明的目的之二是提供上述抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。

3、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、一、具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌肽的结构设计

5、本发明具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌肽，是以不同的β-转角为中心，d型色氨酸和d型赖氨酸交替排列在两侧，然后在c末端进行酰胺化所得，其结构通式为：dkdwdkdwdkzzdkdwdkdwdk-nh2，其中zz＝dpg，pg，dpp，ng，gg。

6、更具体地，所述抗菌肽为：

7、dkdwdkdwdkdpgdkdwdkdwdk-nh2，标记为k-1，氨基酸序列为d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-pro-gly-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-nh2；

8、或：dkdwdkdwdkpgdkdwdkdwdk-nh2，标记为k-2，氨基酸序列为d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-pro-gly-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-nh2；

9、或：dkdwdkdwdkdppdkdwdkdwdk-nh2，标记为k-3，氨基酸序列为d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-pro-pro-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-nh2；

10、或：dkdwdkdwdkngdkdwdkdwdk-nh2，标记为k-4，氨基酸序列为d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-asn-gly-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-nh2；

11、或：dkdwdkdwdkggdkdwdkdwdk-nh2，标记为k-5，氨基酸序列为d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-gly-gly-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-nh2。

12、优选地，所述抗菌肽为dkdwdkdwdkdpgdkdwdkdwdk-nh2或dkdwdkdwdkdppdkdwdkdwdk-nh2，分别标记为k-1和k-3。

13、上述具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌短肽均采用经典固相合成法制备得到。

14、二、具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用

15、1、体外抑菌实验

16、微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。以mh肉汤作为稀释液，使用二倍稀释法依次配制系列梯度的抗菌肽溶液。取所述抗菌肽溶液50μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105cfu/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养18h，观察无细菌生长的最低肽浓度确定为最小抑菌浓度。实验以抗生素polymyxin b、ciprofloxacin和rifampicin作为阳性对照，测试进行3次独立重复，每次重复三个平行实验。检测结果见表1。

17、表1本发明抗菌肽对常见标准菌株的最低抑菌浓度(μm)

18、

19、

20、表1结果显示，本发明抗菌肽对以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌，以及对以肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌为代表的革兰氏阴性菌都有很强的抑制作用，表现为广谱抗菌活性。

21、2、溶血活性试验

22、为了考察本发明合成的抗菌肽对正常哺乳动物细胞的毒性，对本发明抗菌肽与小鼠红细胞(8％v/v)孵育1h后的溶血情况进行测定，结果见图1。

23、图1结果显示，本发明的抗菌肽k-1、k-2、k-3、k-4和k-5在512μm时仍没有表现出明显的溶血活性，而512μm远高于所测其对六种细菌的最低抑菌浓度。说明本发明合成的抗菌肽毒性低，用药安全。

24、3、酶解稳定性试验

25、为了考察本发明合成的β-发卡型抗菌肽对酶的敏感性，我们将抗菌肽与不同浓度的胰蛋白酶和糜蛋白酶共孵育1h，接着在60℃孵育15min将酶灭活，再将酶处理过后的抗菌肽(2×mic)与金黄色葡萄球菌共孵育18h，检测抗菌肽抑菌活性的变化，结果见图2。

26、图2结果显示，本发明的抗菌肽与2000μg/ml的糜蛋白酶或胰蛋白酶孵育1h后仍可以完全抑制金黄色葡萄球菌的生长，说明本发明的β-发卡型抗菌短肽具有很强的酶抵抗性，可以用于口服药物的设计。

27、本发明以不同的β-转角为对称中心，将d型色氨酸和d型赖氨酸交替排列在两侧，得到了中心对称的β-发卡型抗菌肽，该β-发卡型抗菌肽具有高抗菌活性、低溶血毒性和很强的酶解稳定性，在制备临床抗菌药物方面具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一类具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是以β-发卡为结构基础，以不同β-转角为中心、两边d型色氨酸和d型赖氨酸交替排列，然后对c端进行酰胺化得到，其结构通式为：

2.如权利要求1所述的一类具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽为dkdwdkdwdkzzdkdwdkdwdk-nh2，其中zz＝dpg或dpp。

3.如权利要求1或2所述的一类具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。

4.如权利要求3所述的一类具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用，其特征在于，所述抗菌药物为口服抗菌药物。

技术总结
本发明公开了一类具有不同转角的中心对称β‑发卡型抗菌肽及其应用，所述抗菌肽以不同的β‑转角为对称中心，以D型赖氨酸和D型色氨酸交替排列，最后进行C端酰胺化得到，其通式为DKDWDKDWDKzzDKDWDKDWDK‑NH2，其中zz＝DPG，PG，DPP，NG，GG。该类抗菌肽结构设计简单、制造成本低。体外抑菌试验、溶血试验和酶解稳定性实验表明所述抗菌肽对常见的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有强大的抗菌活性、安全性高且具有抗蛋白酶解的优势，在制备临床抗菌药物方面具有良好的应用前景。

技术研发人员：倪京满,王锐,李贝贝,缑三虎
受保护的技术使用者：兰州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1