一类基于G(XXKK)nI模板合成的抗菌肽及其应用

本发明属于生物化学，涉及一类基于g(xxkk)ni模板合成的抗菌肽，本发明同时还涉及该抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。

背景技术：

1、随着抗生素的广泛使用甚至滥用，耐多药细菌在全球的出现对抗生素治疗构成了日益严重的威胁，给全世界造成了巨大的经济负担(antimicrobial resistance&infection control,2014,3(1):32)。目前，全世界每年有70万人死于抗生素耐药(nature,2017,543(mar.2tn.7643):15-15)。而新的抗菌药物的发现和开发速度正在放缓，特别是在抗生素领域。因此，确定和设计具有新型作用模式的抗菌药物，以解决耐药危机是当务之急。

2、细菌的多重耐药性是一个全球性问题，严重威胁人类健康。大多数抗生素通过干扰细胞壁、蛋白质、核酸的生物合成或代谢功能的途径来攻击细菌。细菌很容易通过发展生化溶液来对抗这些特定的过程而进化出对抗生素的耐受能力，从而产生耐药性(acsapplied materials and interfaces,2019,11(38):34609-34620)。而几乎所有抗菌肽的作用靶点都是生物膜，所以抗菌肽产生耐药性的可能性比常规抗生素小，因此，抗菌肽的发现为解决抗生素耐药性问题提供了一种重要途径(nature 415,389–395(2002))。

3、抗菌肽(antimicrobial peptides,amps)是天然存在的生物分子，其分布遍及各种生物的先天免疫系统。由于amps与细菌细胞膜结合，而细菌细胞膜由带负电荷的脂质组成，导致细胞膜渗透。另外，大量的研究结果表明，amps还具有细胞内靶标。在这种情况下，amps诱导细胞死亡的机制还可能涉及与dna/rna的相互作用，从而对蛋白质的合成和细胞内酶的活性产生负面影响，或抑制细胞壁/膜的形成(applied microbiology&biotechnology.2019,vol.103(no.16):6593-6604)。

4、天然抗菌肽由于具有代谢不稳定性、生产成本高、容易引起溶血副作用等缺点限制了它们的进一步临床应用。此外，最近有越来越多的观点认为，临床使用序列与人类amps过于接近的amps将不可避免地损害自身的自然防御，可能对公众健康构成威胁(science,2020,1；368(6490):eaau5480)。在这种观点下，非天然(或合成)肽被开发出来，以提供更广泛的amps武器库。在此基础上，申请人基于自主设计的抗菌肽模板g(xxkk)ni，研究设计具有抗菌谱广且低毒性的抗菌肽，在制备临床抗菌药物方面有很好的应用前景，有希望成为新型抗生素的候选药物。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一类基于g(xxkk)ni模板合成的抗菌肽。

2、本发明的目的之二是提供上述抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。

3、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、一、基于g(xxkk)ni模板合成的抗菌肽的结构设计

5、本发明基于g(xxkk)ni模板合成的抗菌肽，是以g(xxkk)ni为模板，对xxkk序列进行重复，并将c端酰胺化得到，记作xkn；其中，x＝f，w，i，l；n＝2，3，4。

6、本发明抗菌肽序列中，n端的g为谷氨酸(gly)，能够保持一定的稳定性，c端的i为(ile)，能够提供一定的活性；将c端酰胺化可以保持高的净正电荷性。

7、具体的，所述抗菌肽为：ik2、ik3、ik4、lk2、lk3、lk4、fk2、fk3、fk4、wk2、wk3或wk4，其氨基酸序列分别如seq id no.1-12所示。

8、作为本发明技术方案的进一步优选，所述抗菌肽为wk2或fk3。更优选地，所述抗菌肽为wk2。

9、上述基于g(xxkk)ni模板合成的抗菌肽均采用经典固相合成法制备得到。

10、二、基于g(xxkk)ni模板合成的抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用

11、1、体外抑菌实验

12、采用经典微量连续二倍稀释法测定抗菌肽对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)及革兰氏阴性菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌)的最小抑菌浓度。实验以抗生素polymyxin b、cephalothin、streptomycin和rifampicin作为阳性对照，平行重复3次，结果见表1。

13、表1本发明抗菌肽对常见标准菌株的最低抑菌浓度

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16、表1结果显示，本发明抗菌肽对以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为代表的革兰氏阳性菌，和对以大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌为代表的革兰氏阴性菌都具有很强的抑制作用，表现为广谱抗菌活性。抗革兰氏阳性菌的效果优于抗生素polymyxin b，对革兰氏阴性菌的效果优于rifampicin。

17、2、溶血活性实验

18、为了考察本发明合成的抗菌肽对正常哺乳动物细胞的毒性，对本发明抗菌肽与小鼠红细胞孵育1h后的溶血情况进行测定，结果见图1-2。

19、图1-2结果显示，本发明抗菌肽中ik2，lk2和fk2在浓度为256μm时溶血均低于10％，安全性较高。wk2，fk3以及ik3在发生10％的溶血时对应的浓度分别是227.45μm，124.90μm和138.32μm，远高于所测其对五种细菌的最低抑菌浓度，其余抗菌肽溶血毒性高，安全性低。该结果说明，本发明合成的抗菌肽wk2，fk3以及ik3毒性较低，用药安全。

20、3、细胞毒性实验

21、为了考察本发明合成的抗菌肽对hek-293t细胞的毒性，对本发明抗菌肽与hek-293t孵育1h后的细胞存活率进行测定，结果见图3-4。

22、图3-4结果显示，本发明的抗菌肽对细胞的毒性，其中wk2的ic50是53.15μm，而fk3的ic50是16.61μm，的ic50是19.18μm，说明本发明合成的抗菌肽wk2相较于fk3和ik3，序列更短、毒性更低、用药更安全，后续我们将选取wk2进行下一步研究。

23、4、诱导耐药实验

24、抗菌肽与传统抗生素相比，最突出的优势是难以产生耐药性。由于其膜溶解作用机制，细菌很难改变细胞膜成分从而产生耐药。因此，为了研究本发明抗菌肽是否具有不易产生耐药性的特质，我们测定了抗菌肽wk2，抗生素polymyxin b和cephalothin对金黄色葡萄球菌s.aureus atcc 25923和肺炎克雷伯菌k.pneumoniae atcc 700603连续作用15天的抗菌活性。

25、一般而言，mic在1-4倍范围内波动属于正常情况，若mic大于4倍，表明抗生素已产生耐药。如图5和图6所示，传统抗生素cephalothin在连续作用第6/7天时就已产生耐药，在连续作用15天后，对金黄色葡萄球菌的mic已提高了128倍，对肺炎克雷伯菌的mic已提高了16倍。而wk2及多肽抗生素polymyxin b均没有产生耐药性，说明多肽抗菌药物相比传统抗生素，在耐药性方面有明显的优势。

26、5、扫描电镜实验

27、本实验中，我们利用扫描电子显微镜(sem)来直观观察抗菌肽wk2作用后引起的细菌形态的改变。具体的实验方法如下：将生长过夜的金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌在mh培养基中稀释为10×108cfu/ml，离心10000rpm×5min，pbs洗2次，半体积重悬于pbs中，500μl菌液与500μl多肽溶液混合(多肽终浓度为2×mic)，在37℃培养箱中孵育分别孵育30min和2h。时间到后，样品离心10000rpm×10min，加入500μl2.5％戊二醛在4℃条件下固定过夜，随后，pbs洗2遍，用乙醇梯度洗脱(乙醇浓度依次为50％、70％、80％、90％和100％)，加入乙醇静置10min后离心。乙醇梯度洗脱后，加入150μl叔丁醇室温放置2h，离心后将细菌沉淀置于圆形载玻片。样品干燥，喷金，使用apreo s扫描电镜(thermo fisher scientific,ma,usa)进行分析。

28、由图7可观察到，正常的肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌表面光滑完整，但与抗菌肽wk2作用30min后，肺炎克雷伯菌开始出现表面皱缩，细胞内容物泄露，丧失了完整的细胞形态，抗菌肽的效果好于polymyxin b。而金黄色葡萄球菌主要呈现细菌细胞壁产生小泡，并且随着抗菌肽作用时间的延长，造成了更大规模的细菌细胞形态的改变。扫描电镜结果很明显的观察到本发明的抗菌肽wk2对肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌的膜破坏能力远远强于polymyxin b。

29、6、创面细菌感染愈合实验

30、小鼠麻醉后，用剃毛器剃去小鼠背部毛，使用脱毛膏于背部进行脱毛处理至无毛。将小鼠置于木板，背部朝上，固定背部双侧后，利用直径为8mm的皮肤创面圆形切口刀环切皮肤即可，利用透明敷料覆盖。一小时后给菌(mrsa)1×109cfu/ml每孔10μl。间隔给药五次(2mg/ml，每孔20μl)，最后取下敷料，棉签沾取创面，取菌(六次十倍稀释)，涂板子，数菌落数，观察创面愈合情况。

31、图8为发明抗菌肽wk2及polymyxin b的创面细菌感染愈合图，可以观察到，第0天造模创面大小一致，空白组的治愈能力以及给药组的治疗能力能够促进伤口愈合。而模型组中，创面在mrsa感染后第四天，创面发生溃烂。由图9本发明抗菌肽wk2及polymyxin b的创面细菌感染愈合统计图结果显示，空白组细菌数量为0，模型组的细菌数量与空白组之间有显著性差异，说明造模成功。而治疗组我们的抗菌肽wk2以及polymyxin b相对于模型组，细菌数量显著性降低，说明给药后能够杀死细菌促进伤口愈合，从图中还可以知道，我们的抗菌肽wk2治疗效果优于polymyxin b。

32、本发明以g(xxkk)ni为模板，对xxkk序列进行重复，得到抗菌肽xkn，其中，x＝f，w，i，l；n＝2-4；抗菌试验、溶血试验、细胞毒性试验和诱导耐药试验表明本发明的抗菌肽具有抗菌谱广且低毒性的优势、安全性较高。诱导耐药实验表明，本发明的抗菌肽均具有低耐药发生性特点，在制备临床抗菌药物方面有很好的应用前景，有望成为新型抗生素的候选药物。