增强T7RNAP对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法与流程

本发明涉及一种增强t7 rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统及方法，涉及生物进化领域。

背景技术：

1、胶原蛋白家族包含28个亚型44个成员，是人体组织结构的主要组成部分之一，是人体中含量最多的蛋白质，约占25-33％。在皮肤层，胶原蛋白占总蛋白质的70％-90％。一个成年人的身体含有大约2-4公斤的胶原蛋白，随着皮肤老化，胶原蛋白会降解和丢失。胶原蛋白是由三条同源或异源肽链组成的三螺旋纤维蛋白，是维持皮肤、组织和器官形态结构的主要成分。胶原蛋白广泛存在于结膜和结缔组织中，在皮肤、关节和骨骼等生物结构中起连接作用。经证实，胶原纤维的厚度和强度随着年龄的增长而被破坏，这与皮肤老化现象有很强的关系，如皱纹、骨稀疏、肌肉无力等。当真皮层的胶原蛋白被氧化断裂时，对表皮的支撑作用消失，导致不均匀的塌陷和皱纹。

2、由于胶原蛋白对维持身体结构很重要，免疫原性较弱，所以胶原蛋白是美容和医疗领域的明星分子。在医疗中，胶原蛋白可与血小板相互作用产生凝血现象，加速伤口愈合。胶原蛋白与伤口紧密结合，渗透到新的组织中，并作为细胞生长的支架。美容方面，胶原蛋白回填疗法是一种临床证明安全的治疗面部皱纹、疤痕或面部皮肤缺陷的方法。在饮食和涂抹中，补充胶原蛋白裂解液将保持皮肤的年轻状态。因此，胶原蛋白产品有着巨大的市场需求。

3、市场上主要有两种胶原蛋白。一种是动物来源的胶原蛋白，主要来自猪、牛和鱼，主要通过酸法和酶法工业化。该方法具有成本低、产量大、技术成熟等优点，但存在纯度控制困难和动物源性疾病感染的风险，异基因胶原蛋白应用于人体时可能引起免疫排斥反应或过敏反应。另一种是重组人源胶原蛋白，主要是利用基因工程方法对菌株进行修饰以产生胶原蛋白，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和转基因作物。该方法具有蛋白纯度高、免疫原性低的优点，在先进市场上具有更大的应用前景。然而，由于胶原蛋白分子量大，结构可重复性强，天然菌株合成胶原蛋白的能力较弱，这使得重组人胶原蛋白的制备成本极高。

技术实现思路

1、本发明公开了一种增强t7 rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统，包括：

2、(1)m13-t7噬菌体，所述m13-t7噬菌体为giii基因被t7 rnap的编码基因所替代的噬菌体m13；

3、(2)辅助质粒，所述辅助质粒上包含t7启动子介导的胶原蛋白/弹性蛋白-内含肽-piii融合蛋白的表达基因；

4、(3)含f质粒的进化菌株，所述辅助质粒转化到进化菌株中。

5、优选的，所述t7 rnap的氨基酸序列如seq id no.1所示。

6、优选的，所述t7 rnap的编码dna序列如seq id no.2所示。

7、优选的，所述辅助质粒在t7启动子下游插入阻碍t7 rnap延伸的序列。

8、优选的，所述阻碍t7 rnap延伸的序列如seq id no:5所示。

9、优选的，所述胶原蛋白为人胶原蛋白i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii、xiv、xv、xvi、xvii、xviii、xix、xx、xxi、xxii、xxiii、xxiv、xxv、xxvi、xxvii或xxviii；所述弹性蛋白为人弹性蛋白elastin。

10、优选的，所述胶原蛋白/弹性蛋白-内含肽-piii融合蛋白的氨基酸序列如seq idno:3所示，编码dna序列如seq id no.4所示。

11、本发明还公开了一种增强t7 rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化方法，其特征在于其步骤包括：

12、(1)构建上述的定向进化系统；

13、(2)将m13-t7噬菌体转化到进化菌株中，作为初级噬菌体，采用已知的诱导技术，例如artp、诱导质粒等方法诱导突变一段时间后，得到滴度提高的m13噬菌体子代，m13噬菌体子代作为下一轮进化的初级噬菌体，重复上述诱导突变的过程，以获得相较于初始的噬菌体m13效价滴度更高的突变体。

14、采用上述方法，本发明获得了一种t7 rnap突变体，其序列为在seq id no.1所示序列的基础上进行k345e、p474l两点突变。

15、本发明还公开了一种bl21(de3)菌株，其特征在于其基因组中通过crispr转座的方式整合有上述的t7 rnap突变体的编码基因。该菌株可用于改造成表达胶原蛋白或弹力蛋白的工程菌，比如在菌株中转入表达胶原蛋白或弹力蛋白的质粒，或者对菌株的基因组进行改造，使其直接表达胶原蛋白或弹力蛋白。

16、本发明公开的菌株定向进化方法，可以获得具有高转录胶原蛋白和弹力蛋白活性的t7rnap突变体，将t7 rnap突变体整合到宿主菌基因组后，可以获得胶原蛋白和弹性蛋白合成能力增强的菌株。

技术特征：

1.一种增强t7 rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统，其特征在于包括：

2.根据权利要求1所述的定向进化系统，其特征在于，所述t7 rnap的氨基酸序列如seqid no.1所示。

3.根据权利要求2所述的定向进化系统，其特征在于，所述t7 rnap的编码dna序列如seq id no.2所示。

4.根据权利要求1所述的定向进化系统，其特征在于，所述辅助质粒在t7启动子下游插入阻碍t7 rnap延伸的序列。

5.根据权利要求4所述的定向进化系统，其特征在于，所述阻碍t7 rnap延伸的序列如seq id no:5所示。

6.根据权利要求1所述的定向进化系统，其特征在于，所述胶原蛋白为人胶原蛋白i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii、xiv、xv、xvi、xvii、xviii、xix、xx、xxi、xxii、xxiii、xxiv、xxv、xxvi、xxvii或xxviii；

7.根据权利要求6所述的定向进化系统，其特征在于，所述胶原蛋白/弹性蛋白-内含肽-piii融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:3所示。

8.一种增强t7 rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化方法，其特征在于其步骤包括：

9.一种t7 rnap突变体，其特征在于其序列为在seq id no.1所示序列的基础上进行k345e、p474l两点突变。

10.权利要求1所述的t7 rnap突变体的编码基因。

11.一种bl21(de3)菌株，其特征在于其基因组中整合有权利要求10所述的t7 rnap突变体的编码基因。

12.权利要求11所述的bl21(de3)菌株在表达胶原蛋白或弹力蛋白中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述bl21(de3)菌株中还含有表达胶原蛋白或弹力蛋白的质粒。

技术总结
本发明公开了一种增强T7RNAP对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统，包括：(1)M13‑T7噬菌体，所述M13‑T7噬菌体为gIII基因被T7RNAP的编码基因所替代的噬菌体M13；(2)辅助质粒，所述辅助质粒上包含T7启动子介导的胶原蛋白/弹性蛋白‑内含肽‑pIII融合蛋白的表达基因；(3)含F质粒的进化菌株，所述辅助质粒转化到进化菌株中。还公开了相应的进化方法及筛选到的T7RNAP突变体。本发明公开的菌株定向进化方法，可以获得具有高转录胶原蛋白和弹力蛋白活性的T7RNAP突变体，将T7RNAP突变体整合到宿主菌基因组后，可以获得胶原蛋白和弹性蛋白合成能力增强的菌株。

技术研发人员：刘丽花,张志乾,吴奕瑞,江翱,吴嵩,许波,邱益,陈西朋,何茜,何景涛,周海银
受保护的技术使用者：态创生物科技（广州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15