获取抗红细胞干扰的清除试剂的方法及其应用与流程

本发明属于生物，涉及抗红细胞抗体的制备、抗红细胞干扰的清除试剂的获取与应用，尤其涉及一种快速获取抗红细胞干扰的清除试剂的方法以及抗红细胞干扰的清除试剂的快速高效的筛选与应用。

背景技术：

1、红细胞是血细胞的主要成分，携带血红素，在免疫检测常常会带来额外的背景，从而影响到对结果的直接判断。有多种手段可以实现红细胞的有效清除，常用的方式有差速离心、梯度离心、使用细胞裂解液、特异性红细胞清除试剂等。离心法不仅能够清除红细胞还能够清除其他类型的细胞，在离心的过程中很可能造成细胞的破碎，胞内物质释放，同时产生细胞碎片。细胞裂解液主要是氯化铵等高渗溶液，能够有效清除大部分的细胞。特异性红细胞清除试剂多为特异性抗体，能够识别红细胞表面抗原，从而结合红细胞，达到吸附红细胞的目的。

2、但是存在以下几个问题：

3、1)离心法能够很好的去除细胞，但是处理繁琐，不适用于大量样本的处理，而且会造成处理的不完全，主要表现细胞残留以及细胞破碎，导致细胞碎片以及胞内释放物质对免疫检测的严重干扰。

4、2)红细胞裂解液是含有化学成分的高渗透溶液，对样本本身存在一些不确定的影响，同时产生大量细胞碎片，会造成检测的干扰。

5、3)红细胞表面抗原特异性抗体类的红细胞清除试剂，仅对红细胞表面可能存在的抗原具有识别性和红细胞吸附能力，而红细胞表面的抗原并不呈均匀分布，识别性不稳定，存在红细胞的吸附不完全的问题。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了获取抗红细胞干扰的清除试剂的方法及其应用，本发明根据红细胞等细胞的生物膜结构特性，基于红细胞在凝血因子等作用下会发生凝血的天然特性，根据其血凝特点开发快速获得抗红细胞抗体的方法，并筛选获得能够完全清除红细胞等生物膜的试剂。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明首先提供了一种快速获取抗红细胞干扰的清除试剂的方法，所述方法包括以红细胞膜的碎片作为免疫原，提取得到红细胞膜后，进行红细胞膜免疫，筛选获得具有红细胞结合能力的细胞株，使用培养的细胞上清对细胞株的抗体进行初步的鉴定，保留性能较好的，再进行抗体的多次评估，最终筛选出效果最佳的抗体；使用相同培养条件下不同细胞株系的培养上清进行红细胞的血凝抑制测试，根据抑制度判断细胞株的性能，抑制程度越高的细胞株系效果越差，反之越好，从而获取抗红细胞干扰的清除试剂。

4、作为本发明的一种优选方案，所述红细胞膜碎片为人红细胞膜的碎片。

5、作为本发明的一种优选方案，红细胞膜免疫的方法包括将得到的红细胞膜稀释，配合q佐剂对小鼠进行腹腔多次免疫，获得满足免疫效果的红细胞膜。

6、作为本发明的一种优选方案，红细胞膜抗体筛选的方法包括：使用提纯的红细胞膜或者红细胞进行细胞株的筛选，获得具有红细胞结合能力的细胞株；相同培养时间内的细胞株所分泌的抗体量差异较小，使用培养的细胞上清对其抗体的性能进行初步的鉴定，保留性能较好的，再进行抗体的多次评估，筛选出效果最佳的抗体；使用相同培养条件下不同株系的培养上清进行红细胞的血凝抑制测试，根据抑制度判断细胞株的性能，抑制程度越高的株系效果越差，反之越好。

7、本发明提供了采用上述的方法得到的抗红细胞干扰的清除试剂。

8、作为本发明的一种优选方案，抗红细胞干扰的清除试剂工作浓度不低于0.234μg/ml时，能够完全清除浓缩至15％的红细胞。

9、作为本发明的一种优选方案，抗红细胞干扰的清除试剂的抗体亚型包括igg3_kappa或者igg1_kappa。

10、本发明还提供了一种抗红细胞干扰的清除试剂在免疫检测平台的应用。

11、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

12、1)本发明提供的抗红细胞干扰的清除试剂的制备：采用区别于常规的蛋白类免疫原、小分子免疫原、皮下/肌肉/静脉免疫等传统高效免疫方式，使用非蛋白类的细胞碎片配合q佐剂进行腹腔免疫，免疫剂量少、免疫滴度高、免疫动物健康状态更好，更少的免疫原使用量保证了更高的免疫活性和免疫动物成活率。

13、2)本发明提供筛选方法基于红细胞在凝血因子等作用下的血凝特性，短时间内高效筛选未纯化蛋白，筛选样本不限于细胞培养上清液、腹水、免疫血清等；筛选所得抗体均具有高效的红细胞结合特性。

14、3)本发明筛选得到的抗红细胞干扰的清除试剂，工作浓度不低于0.234μg/ml时可完全清除浓缩至15％的红细胞。

15、4)本发明的方法不局限于抗红细胞抗体的制备以及筛选，经过适当的优化能够适用于所有常规细胞类型。

技术特征：

1.一种获取抗红细胞干扰的清除试剂的方法，其特征在于，所述方法包括以红细胞的碎片作为免疫原，提取得到红细胞膜后，进行红细胞膜免疫，筛选获得具有红细胞结合能力的细胞株，使用培养的细胞上清对细胞株的抗体进行初步的鉴定，保留性能较好的，再进行抗体的纯化，然后再对纯化抗体进行二次评估，最终筛选出效果最佳的抗体；使用相同培养条件下不同细胞株系的培养上清进行红细胞的血凝抑制测试，根据抑制度判断细胞株的性能，抑制程度越高的细胞株系效果越差，反之越好，从而获取抗红细胞干扰的清除试剂。

2.根据权利要求1所述的一种获取抗红细胞干扰的清除试剂的方法，其特征在于，所述红细胞膜碎片为人红细胞膜的碎片。

3.根据权利要求1所述的一种获取抗红细胞干扰的清除试剂的方法，其特征在于，红细胞膜免疫的方法包括将得到的红细胞膜稀释，配合q佐剂对小鼠进行腹腔多次免疫，获得满足细胞融合条件的能够产生抗红细胞抗体的免疫小鼠。

4.根据权利要求1所述的一种获取抗红细胞干扰的清除试剂的方法，其特征在于，抗红细胞抗体筛选的方法包括：使用提纯的红细胞膜或者红细胞进行细胞株的筛选，获得具有红细胞结合能力的细胞株；相同培养时间内的细胞株所分泌的抗体量差异较小，使用培养的细胞上清对其抗体的性能进行初步的鉴定，保留性能较好的，再进行抗体的多次评估，筛选出效果最佳的抗体；使用相同培养条件下不同株系的培养上清进行红细胞的血凝抑制测试，根据抑制度判断细胞株的性能，抑制程度越高的株系效果越差，反之越好。

5.一种抗红细胞干扰的清除试剂，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的方法得到的抗红细胞干扰的清除试剂。

6.根据权利要求5所述的一种抗红细胞干扰的清除试剂，其特征在于，抗红细胞干扰的清除试剂工作浓度不低于0.234μg/ml时，能够完全清除浓缩至15％的红细胞。

7.根据权利要求5所述的一种抗红细胞干扰的清除试剂，其特征在于，抗红细胞干扰的清除试剂的抗体亚型包括igg3_kappa或者igg1_kappa。

8.一种抗红细胞干扰的清除试剂的应用，其特征在于，所述抗红细胞干扰的清除试剂在免疫检测平台的应用。

技术总结
本发明提供了获取抗红细胞干扰的清除试剂的方法与应用，红细胞干扰清除试剂，以红细胞的碎片作为免疫原，提取得到红细胞膜后，进行红细胞膜免疫，筛选获得具有红细胞结合能力的细胞株，使用培养的细胞上清对细胞株的抗体进行初步的鉴定，保留性能较好的，再进行抗体的纯化，然后再对纯化抗体进行二次评估，最终筛选出效果最佳的抗体；使用相同培养条件下不同细胞株系的培养上清进行红细胞的血凝抑制测试，根据抑制度判断细胞株的性能，抑制程度越高的细胞株系效果越差，反之越好，从而获取抗红细胞抗体。本发明筛选得到的抗体，工作浓度部低于0.234μg/mL时可完全清除浓缩15％的红细胞。

技术研发人员：李国强,高艺征,刘世成,杨孝丽
受保护的技术使用者：杭州启泰生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15