一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学，涉及核酸适配体，尤其涉及一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体及其应用。

背景技术：

1、盐酸多奈哌齐是一种长效的阿尔茨海默病(ad)的对症治疗药。ad是一种以记忆减退为主要表现，伴有其他认知功能损害的获得性智能减退。近30年的研究表明：ad胆碱能神经元的进行性退变是记忆力减退、定向力丧失、行为和个性改变的原因，这种胆碱能理论已被组织学研究证实。盐酸盐酸多奈哌齐是第二代胆碱酯酶(che)抑制剂，其治疗作用是可逆性地抑制乙酰胆碱酯酶(ache)引起的乙酰胆酰水解而增加受体部位的乙酰胆碱含量。盐酸多奈哌齐可能还有其他机制，包括对肽的处置、神经递质受体或ca2+通道的直接作用。

2、盐酸盐酸多奈哌齐对ache的选择亲和力比对丁酰胆碱酯酶(bche)强1250倍，它能明显抑制脑组织中的che，但对心脏(心肌)或小肠(平滑肌)无作用，可能对胸部组织(横纹肌)有作用；对中枢神经毒性比他克林小。

3、盐酸多奈哌齐口服后3-4小时达血浆峰浓度，血浆浓度和药时曲线下面积与剂量成正比。消除半衰期约70小时，所以，多次每日单剂量给药将缓慢达到稳态。治疗开始后3周内达稳态，稳态后，血浆盐酸盐酸多奈哌齐浓度和相应的药效学活性在一日中变化很小。饮食对盐酸盐酸多奈哌齐的吸收无影响。

4、但是，对于药物的吸收与代谢强度是因人而异的，不同的人在一定时间内体内药物浓度区别可能很大，因此，针对不同的人群，需要合理用药，体内药物浓度检测成了重要的一环，目前主要检测手段是hplc法，也有用微流控芯片取检测的，样品需要比较复杂的处理，且比较耗费时间，成本较高。

5、核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(selex)筛选分离得到的dna或者rna分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。

6、主要缺陷在于：盐酸多奈哌齐作为一种治疗阿尔兹海默症的药物，其血药浓度和用法用量对于病人来说都是极其重要的，准确测量不同病人在不同用药时间内的血药浓度可以帮助病人准确和合理用药，大大提高药物的作用并降低副作用。

7、目前临床上检测盐酸多奈哌齐含量主要是hplc法等。操作比较复杂，不适于高通量检测，成本也比较高，前处理相对麻烦。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体及其应用，本发明筛选获得高亲和力，高特异性的盐酸多奈哌齐核酸适配体，可为盐酸多奈哌齐的检测提供一种新的策略，取代传统方法，降低成本，提高盐酸多奈哌齐检测结果的准确性和可靠性，利用多种检测平台检测，对病人精准用药具有很大的意义。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供了一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体，包括seq idno.1所示的核苷酸序列；或者，与seq id no.1核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核苷酸序列；或者由seq id no.1所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核苷酸序列；

4、seq id no.1：gggaccagcacacgcataacctgtctatacaagaccgggaccccactggagctagggcgttatgcgtgctaccgtg。

5、作为本发明的一种优选方案，所述具有高同源性是指与seq id no.1所示的核苷酸序列至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同源性。

6、作为本发明的一种优选方案，所述核酸适配体包含与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列并且保持亲和力。

7、作为本发明的一种优选方案，所述核酸适配体的核苷酸序列包含碱基修饰并且保持亲和力。

8、作为本发明的一种优选方案，所述碱基修饰为硫代修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、氨基化修饰、巯基化修饰、硒取代氧修饰或连接同位素修饰。

9、本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合盐酸多奈哌齐小分子的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

10、作为本发明的一种优选方案，所述核酸适配体的核苷酸序列包含标记物并且保持亲和力。

11、作为本发明的一种优选方案，所述标记物为荧光标记物，放射性标记物、治疗性标记物、生物素标记物、地高辛标记物、纳米发光材料标记物、小肽标记物、sirna标记物或酶标记物。

12、本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质，放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna或酶标记等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合盐酸多奈哌齐小分子的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

13、本发明还提供了上述的特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体的应用，利用所述特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体检测盐酸多奈哌齐小分子。

14、本发明还提供了包含上述特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体的检测试剂盒。

15、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

16、1)核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，因此核酸适配体是一种非常理想的分子探针。针对于盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体还没有人公布且没有人应用该适配体，因此，本领域对针对盐酸多奈哌齐小分子有高结合亲和力的核酸适配体存在需求。

17、2)核酸适配体相较于抗体，更稳定，由于是化学合成，批间差异几乎没有；并将该核酸适配体成功用于盐酸多奈哌齐小分子的检测。

18、3)本发明提供了一种具有高度特异性、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的筛选方法与应用。

技术特征：

1.一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体，其特征在于，包括seq id no.1所示的核苷酸序列；或者，与seq id no.1核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核苷酸序列；或者由seq id no.1所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核苷酸序列；

2.根据权利要求1所述的一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体，其特征在于，所述具有高同源性是指与seq id no.1所示的核苷酸序列至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同源性。

3.根据权利要求1或2所述的一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体包含与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列并且保持亲和力。

4.根据权利要求1或2所述的一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包含碱基修饰并且保持亲和力。

5.根据权利要求4所述的一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体，其特征在于，所述碱基修饰为硫代修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、氨基化修饰、巯基化修饰、硒取代氧修饰或连接同位素修饰。

6.根据权利要求1或2所述的一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包含标记物并且保持亲和力。

7.根据权利要求6所述的一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体，其特征在于，所述标记物为荧光标记物，放射性标记物、治疗性标记物、生物素标记物、地高辛标记物、纳米发光材料标记物、小肽标记物、sirna标记物或酶标记物。

8.权利要求1-7任一项所述的特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体的应用，其特征在于，利用所述特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体检测盐酸多奈哌齐小分子。

9.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体。

技术总结
本发明公开了一种特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体及其应用，包括SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列；或者，与SEQ ID No.1核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核苷酸序列；或者由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合盐酸多奈哌齐小分子的核苷酸序列。本发明提供了一种具有高度特异性、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合盐酸多奈哌齐小分子的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的筛选方法与应用。

技术研发人员：吴超超,牛成镇,高强,朱建国
受保护的技术使用者：杭州佰辰医学检验所有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15