受铵盐诱导的脱氮副球菌启动子P1690

本发明涉及受铵盐诱导的脱氮副球菌启动子p1690，属于合成生物学领域。

背景技术：

1、由于氮污染物来源广泛、污染途径及过程复杂、传统的脱氮技术处理效果不高、新的脱氮技术难以实现规模化应用等原因，由此可见氮污染是难以控制，而且解决氮污染也是相当困难的。生物脱氮是目前污水脱氮处理中最常用也是最有效的方法，而选取具有脱氮功能的菌株是生物脱氮的基础。

2、为了降解复杂污水环境中的氮素，获得高效的氮素降解微生物也是至关重要的，这将可能从根本上解决目前脱氮工程中面临的困难。随着对脱氮微生物的深入了解，研究人员发现有些脱氮菌中存在异养硝化和好氧反硝化的偶联过程，此类菌被称为异养硝化-好氧反硝化菌(heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacteria,hn-ad)。hn-ad菌的发现为单级脱氮工艺提供了基础，突破了硝化菌与反硝化菌共培养脱氮的传统脱氮工艺。脱氮副球菌(paracoccus denitrificans)具有硝化与好氧反硝化一体的功能，因此成为脱氮的模式菌种。p.denitrificans是一种革兰氏阴性菌，形态为球状，既能生活在好氧条件下，也能在厌氧的环境中生存，适应性较强。目前已有研究提出脱氮副球菌不仅能够进行好氧反硝化作用，还能够将氨氮转化为亚硝态氮，具有异养硝化功能。p.denitrificans除了具有脱氮的功能外，还对有机污染物具有很高的降解能力，可应用于含有氰化物、吡啶、苯等多种有机污染物的污水生物处理以及被污染土壤的生物修复。因此，p.denitrificans在新型废水生物脱氮中具有一定的研究价值和应用潜力。

3、脱氮副球菌基因工程，是改良p.denitrificans降解氨氮的一种手段。然而，在p.denitrificans中缺少高效的遗传转化系统，大大限制了基因工程在p.denitrificans中降解氨氮的应用。因此，很有必要建立一套高效的遗传转化系统。其中载体是遗传转化体系的核心部分，而启动子是载体能否高效表达的关键元件。因此，针对p.denitrificans在生物氮循环中的重要作用，开展p.denitrificans铵盐诱导型基因元件启动子的挖掘和功能性研究，有助于建立适用于p.denitrificans高效率的遗传转化系统，提高p.denitrificans降解氨氮的效率。

技术实现思路

1、本发明提供了铵盐诱导型启动子p1690，具有如seq id no.5所示的核苷酸序列，能够启动在脱氮副球菌中的基因转录。

2、本发明还提供了含铵盐诱导型启动子的重组表达载体，所述重组表达载体能够允许插入目的基因并使目的基因在细菌中表达出蛋白。

3、在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pind4。

4、在一种实施方式中，所述细菌包括但不限于：类球红细菌(rhodobactersphaeroides)、脱氮副球菌(paracoccus denitrificans)pd1222；所述脱氮副球菌pd1222公开于论文《一种酸性脲酶的纯化及产生菌的鉴定与分析》。

5、本发明还提供了含所述重组表达载体的重组微生物细胞。

6、在一种实施方式中，所述重组微生物细胞的宿主为好氧反硝化脱氮副球菌dytn-1，该菌株公开于2019年公开的论文《脱氮副球菌dytn-1高效去除污水中的总氮》中。

7、本发明还提供了一种表达外源蛋白的方法，是将所述铵盐诱导型启动子置于目的基因上游，在含铵盐的环境下培养携带所述目的基因的微生物细胞。

8、在一种实施方式中，所述方法包括：将携带了铵盐诱导型启动子和目的基因的重组表达载体转入微生物细胞中，在含铵盐的环境下培养所述微生物细胞。

9、在一种实施方式中，所述方法是将所述微生物细胞在培养基中培养一段时间后，加入铵盐诱导基因的表达。

10、在一种实施方式中，所述微生物细胞的制备方法包括：将所述重组表达载体转入供体菌株中，然后将供体菌株和受体菌株按照一定比例混合均匀，使其直接接触，在此过程中辅助菌株驱使重组载体向受体中迁移完成接合转移。

11、在一种实施方式中，所述培养将所述微生物细胞在含铵盐的m9培养基中，于30～37℃培养至少48h。

12、在一种实施方式中，所述铵盐的浓度为1mg/l～2g/l。

13、在一种实施方式中，所述微生物细胞以脱氮副球菌dytn-1为宿主，以pind4为载体。

14、本发明还提供了所述铵盐诱导型启动子、所述重组表达载体、所述重组微生物细胞或所述方法在调控目的蛋白表达方面的应用。

15、有益效果：本发明通过接合方式在脱氮副球菌中成功筛选到15个受铵盐诱导的不同表达强度启动子，分别是p1849、prpsu、p2495、pmdh、p1851、p2068、p4130、p2486、p2480、p1869、pcs、prpst、p4462、pnir和p1690，上述启动子在铵盐存在的情况下单位od的荧光响应值是无铵盐时的9～32倍,可作为基因表达调控元件，用于精细调控基因表达、精细调控代谢通路，具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.铵盐诱导型启动子，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.5所示。

2.含权利要求1所述铵盐诱导型启动子的重组表达载体。

3.含权利要求2所述重组表达载体的重组微生物细胞。

4.根据权利要求3所述的重组微生物细胞，其特征在于，宿主包括类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)或脱氮副球菌(paracoccus denitrificans)。

5.根据权利要求3所述的重组微生物细胞，其特征在于，以脱氮副球菌dytn-1为宿主，以pind4为载体。

6.一种调控蛋白表达量的方法，其特征在于，将权利要求1所述的铵盐诱导型启动子置于目的基因上游，再在含铵盐的环境下培养携带所述目的基因的微生物细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微生物细胞以脱氮副球菌dytn-1为宿主，以pind4为载体。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养将所述微生物细胞在含铵盐的m9培养基中，于30～37℃培养至少48h。

9.根据权利要求6～8任一所述的方法，其特征在于，所述铵盐的浓度为1mg/l～2g/l。

10.权利要求1所述的铵盐诱导型启动子、权利要求2所述的重组表达载体、权利要求3～5任一所述的重组微生物细胞或权利要求6～9任一所述方法在表达目的蛋白方面的应用。

技术总结
本发明公开了受铵盐诱导的脱氮副球菌启动子P1690，属于合成生物学领域。本发明脱氮副球菌基因组中筛选出15个受铵盐诱导的可调控不同表达强度的启动子P<subgt;1849</subgt;、P<subgt;rpsu</subgt;、P<subgt;2495</subgt;、P<subgt;mdh</subgt;、P<subgt;1851</subgt;、P<subgt;2068</subgt;、P<subgt;4130</subgt;、P<subgt;2486</subgt;、P<subgt;2480</subgt;、P<subgt;1869</subgt;、P<subgt;cs</subgt;、P<subgt;rpst</subgt;、P<subgt;4462</subgt;、P<subgt;nir</subgt;和P<subgt;1690</subgt;，将上述启动子用于脱氮副球菌中调控荧光蛋白的表达，在铵盐存在的情况下单位OD的荧光响应值是无铵盐时的9～32倍，可作为基因表达调控元件，用于精细调控基因表达、精细调控代谢通路，具有广泛的应用前景。

技术研发人员：周胜虎,邓禹,牛晓倩,赵运英,毛银,李国辉
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15