改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种改造的免疫细胞、靶向kmt5a基因的grna和应用。

背景技术：

1、免疫细胞在癌症、传染病和自身免疫的免疫控制中发挥着重要作用。以细胞毒性t细胞为例，cd8+t细胞是细胞毒性免疫细胞，通过直接杀伤肿瘤细胞发挥抗肿瘤免疫作用。抗原特异性cd8+t细胞的激活由t细胞受体(tcr)识别主要组织相容性复合体(mhc)i类(mhc-i)提呈的同源抗原，导致t细胞增殖、细胞因子产生和靶细胞杀伤。t细胞缺陷可导致反复感染或癌症，而cd8+t细胞的过度激活可导致免疫病理学和自身免疫。cd8+t细胞已成为新的癌症治疗药物的聚焦点。经批准的免疫检查点抑制剂通过中和ctla-4或pd-1/pd-l1增强cd8+t细胞的抗肿瘤反应。无论是单药还是与其他疗法联合使用，这些药物在多种肿瘤适应症中都有效。

2、利用免疫细胞与嵌合抗原的细胞治疗受体(cars)已证明在治疗肿瘤方面取得了临床成功。发现以前未知的调节免疫细胞功能的基因，可为免疫疗法开辟不同的途径，因为很大一部分患者对目前批准的疗法仍然没有反应或有不希望有的副作用。

3、kmt5a(赖氨酸甲基转移酶5a)，kmt5a被称为set8、pr-set7/9或setd8，是含有set结构域的蛋白赖氨酸甲基化酶(protein lysine methyltransferases，kmt)的家族成员之一。kmt5a能够通过催化组蛋白h4第20位赖氨酸的单甲基化(h4k20me1)而在多种生物过程中发挥关键作用，包括基因转录控制、复制起源调节、基因组完整性维持和细胞周期进展和发育。越来越多的证据表明set8可能参与肿瘤的发展和进展(例如，有研究者认为在三阴性乳腺癌的发生和转移过程中，体内发生kmt5a甲基化依赖性调节机制，该机制使snip1具有致癌功能)，然而kmt5a在肿瘤免疫治疗中的作用尚不清楚。

4、但目前对于kmt5a基因进行修饰，从而改造免疫细胞的研究尚处于空白阶段，crispr/cas9系统可以在体外切割双链dna，cas9蛋白可以被输送到人类原代细胞，以有效地敲除检查点基因，甚至重写内源性基因组序列，该系统已被用于下一代过继细胞疗法的开发应用。但目前仍需要开发出更加安全有效的kmt5a基因修饰方法以改造免疫细胞。

5、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种改造的免疫细胞，以期进一步提高免疫细胞对肿瘤的杀伤能力。本发明的第二目的在于提供上述改造的免疫细胞的制备方法和用于制备方法中涉及的相关产品，以提高上述改造的免疫细胞的制备效率。本发明的目的还在于提供包括上述改造的免疫细胞及其制备方法在肿瘤药物方面的应用。

2、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

3、根据本发明的一个方面，提供了一种改造的免疫细胞，所述免疫细胞的kmt5a基因表达被下调或清除。

4、优选地，所述免疫细胞选自t细胞、b细胞、天然杀伤细胞、粒细胞、肥大细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和/或外周血单个核细胞。

5、优选地，所述kmt5a基因表达被下调或清除是通过至少一种crispr/cas基因编辑系统进行了基因编辑。

6、优选地，所述crispr/cas基因编辑系统包含靶向kmt5a基因的grna，所述grna的靶点序列如seq id no.1所示，或为其反向互补序列。

7、根据本发明的另一个方面，还提供了一种靶向kmt5a基因的grna，所述grna的靶点序列如seq id no.1所示，或为其反向互补序列。

8、根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于编辑kmt5a基因的组合物，该组合物包含(ⅰ)和(ⅱ)：

9、(ⅰ)如上述的靶向kmt5a基因的grna或编码所述grna的多核苷酸；

10、(ⅱ)cas核酸酶或编码cas核酸酶的多核苷酸。

11、根据本发明的另一个方面，还提供了上述改造的免疫细胞的制备方法，包括获得上述用于编辑kmt5a基因的组合物，将所述组合物引入免疫细胞，从而使kmt5a基因表达被下调或清除。

12、根据本发明的另一个方面，还提供了一种递送系统，所述递送系统包括活性成分和递送载体，所述活性成分包括上述的靶向kmt5a基因的grna，或上述的用于编辑kmt5a基因的组合物；所述递送载体包括脂质体、纳米颗粒、基因枪或电转设备。

13、根据本发明的另一个方面，还提供了上述的改造的免疫细胞，或上述的靶向kmt5a基因的grna，或上述的用于编辑kmt5a基因的组合物，或上述改造的免疫细胞的制备方法，或上述递送系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

14、根据本发明的另一个方面，还提供了用于治疗肿瘤的药物，包括上述改造的免疫细胞。

15、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

16、本发明提供的改造的免疫细胞通过下调或清除kmt5a基因的表达提高了增强了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，共培养条件下，清除率达到了约75％；同时还能增强免疫细胞细胞因子分泌和脱颗粒能力，进一步增强了免疫细胞的杀伤效果。下调或清除免疫细胞中kmt5a基因的表达还大幅提高了免疫细胞的增殖能力。

17、本发明利用crispr/cas技术对免疫细胞的kmt5a基因进行修饰，选择性地敲除kmt5a基因，进而获得了能够有效抑制肿瘤的免疫细胞。

18、本发明提供的靶向kmt5a基因的grna靶向特异性好，脱靶率低，可以实现对kmt5a基因进行有效编辑，编辑效率高达66％，能有效敲低kmt5a基因的表达，所构建的免疫细胞所带有的突变基因型稳定性高，具有可遗传性。

19、本发明提供的改造的免疫细胞制备方法简单有效，成本低，所制备的免疫细胞具有持续、高效肿瘤抑制效果，安全性好的优势。

技术特征：

1.一种改造的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞的kmt5a基因表达被下调或清除。

2.根据权利要求1所述的改造的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞选自t细胞、b细胞、天然杀伤细胞、粒细胞、肥大细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和/或外周血单个核细胞。

3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞，其特征在于，所述kmt5a基因表达被下调或清除是通过至少一种crispr/cas基因编辑系统进行了基因编辑。

4.根据权利要求3所述的免疫细胞，其特征在于，所述crispr/cas基因编辑系统包含靶向kmt5a基因的grna，所述grna的靶点序列如seq id no.1所示，或为其反向互补序列。

5.一种靶向kmt5a基因的grna，其特征在于，所述grna的靶点序列如seq id no.1所示，或为其反向互补序列。

6.用于编辑kmt5a基因的组合物，其特征在于，包含(ⅰ)和(ⅱ)：

7.权利要求1～4任一项所述的改造的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括获得权利要求6所述的组合物，将所述组合物引入免疫细胞，从而使kmt5a基因表达被下调或清除。

8.一种递送系统，其特征在于，所述递送系统包括活性成分和递送载体，所述活性成分包括权利要求5所述的grna，或权利要求6所述的组合物；所述递送载体包括脂质体、纳米颗粒、基因枪或电转设备。

9.权利要求1～4任一项所述的改造的免疫细胞，或权利要求5所述的grna，或权利要求6所述的组合物，或权利要求7所述的制备方法，或权利要求8所述的递送系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

10.用于治疗肿瘤的药物，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的免疫细胞。

技术总结
本发明提供了一种改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用，涉及生物技术领域。本发明提供的改造的免疫细胞通过下调或清除KMT5A基因的表达，增强了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本发明提供的靶向KMT5A基因的gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1所示，或为其反向互补序列，具有编辑效率高的优势，为免疫疗法开辟了新的途径。

技术研发人员：吴宇轩,田晓玲,刘国龙
受保护的技术使用者：尧唐（上海）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16