一种多功能固氮促生菌、培养基、筛选及应用

本发明属于微生物，具体地说，涉及一种多功能固氮促生菌、培养基、筛选及应用。

背景技术：

1、农业生产过程中，工业氮肥作为最重要的农业生产投入品之一，在提高农作物产量上起着重大的作用，是实现粮食增产最便捷的方法。自上世纪七十年代以来，工业氮肥就已经引入了我国，随着国家人口的增长和经济的发展，我国工业氮肥的施用量迅速增加，如今在世界各国中已成为工业氮肥使用量最大的国家之一。工业氮肥的大量使用虽然增加了粮食产量，满足了我国庞大人口对粮食的需求，同时也出现了由于利用效率低下导致氮肥使用超标以及施用方式的不当的问题。因此，氮肥的超负荷使用不仅消耗了大量能源，同时也引发了如水体富营养、土壤养分失调等众多环境问题。

2、除了施用工业氮肥外，还存在一种重要的却易被忽视的氮素合成途径—生物固氮。生物固氮是固氮微生物特有的一种生理特性，是在固氮酶的催化下将大气中的分子态氮还原为可被植物吸收的氨的过程。按固氮微生物和其他生物间的关系，可将其划分为自身固氮微生物、共生固氮微生物和联合固氮微生物三类。其中，联合固氮微生物因其能存活于玉米等禾本科植物且不需结瘤就可发挥作用，自身固氮效率高等优势，常被用于微生物肥料，增产效果良好。联合固氮菌对植物的生长起着积极的作用，能够为植物提供氮源、产生植物激素类物质、阻止有害菌的入侵等。

3、因此，随着人们对生态环境的日益重视，迫切需要找到一种不仅能够增加粮食产量保证粮食安全又可以提升土壤肥力保护生态环境的新途径。因此研究植物自身生物学特性，利用氮素合成的其他有效途径，如生物固氮，配合适宜的接种方式，才是建设环境友好型可持续发展农业的必经之路。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种多功能固氮促生菌、培养基、筛选及应用，该菌剂为单一菌剂，具备良好的耐盐属性，且产吲哚乙酸生长素和铁载体的能力都很强，可用于提高作物的固氮能力和耐盐能力，除此之外对植物的生长也有良好的促进作用。为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

2、一种固氮促生菌的筛选及其菌剂的制备和应用，

3、所述菌剂微生物为：鞘脂单胞菌gb-γ，保藏编号cgmcc no.25946，保藏时间2022年10月21日。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。菌株于2022年1月筛选于北京市海淀区的根系发达的水培植物-水竹-根表面。该菌株的生物学特征为：菌落在低氮培养基(0.2g/l蛋白胨)上30℃划线培养，经36-48h培养后长出单菌落。菌落特征：菌落圆形，无光泽，边缘不明显，菌落呈黄色，略有粘性，直径为2-3mm，好氧，化能异养。低氮培养基的成分包括：蔗糖5.0g、苹果酸钠2.5g、k2hpo4·3h2o 0.05g、kh2po40.2 g、mgso4·7h2o 0.1g、nacl 0.1g、cacl20.02 g、fecl3·6h2o 0.01g、na2moo4·2h2o0.002g、蛋白胨0.2g、蒸馏水1000ml。调节培养基ph为7.0，培养箱温度为30℃，培养时间为36-48h。

4、在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将其扩大培养制成微生物菌剂的形式以扩大其应用范围。

5、本发明多功能固氮促生菌的筛选方法包括以下几个步骤：

6、a.固氮菌株筛选：

7、从北京实验室原有的根系发达的水培植物水竹上采集其根组织，称取5g根组织与灭菌pbs溶液中，通过十倍稀释，分别稀释至10-1、10-2、10-3梯度，充分混匀。各梯度取0.1ml涂布于低氮培养基平板上，于30℃培养2-3d，继续用接种环挑取不同单菌落进行平板划线纯化，得到单一菌落的固氮菌株。将于低氮培养基下纯化的菌株在不同nacl浓度的低氮培养基上培养进行菌株耐盐性的检测，采用乙炔还原法进行固氮酶活性的检测，采用salkowski显色法进行产iaa能力的检测，采用cas检测法进行产铁载体能力检测，筛选出具备耐盐、产iaa、产铁载体的多功能固氮促生作用的菌株。

8、b.菌种鉴定：16s rrna序列分析。

9、将a中纯化筛选得到的目标菌株提取dna并作为模板，16s rdna通用引物为引物，对16s rdna核苷酸片段进行扩增，将扩增的片段直接进行序列测定，根据测定结果得出目标菌株的名称并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

10、评估菌株在作物上的应用：采用种子包衣和拌菌肥的两种接种方式，将目标菌株接种于玉米上，收获作物通过测定其生物量等指标，评估菌株的固氮促生效果。具体步骤：

11、a.通过对菌种在低氮培养基上进行活化，得到种子菌；

12、b.按照1％的比例接种到液体低氮培养基中，在30℃、150rpm的培养条件下进行36小时的培养；

13、c.培养好的菌液中添加1％的海藻糖溶液，将一部分菌液离心，得到固体菌体，用于制备种子包衣，另一部分菌液与灭菌泥炭土按1：1混合，使菌液完全吸附于泥炭土，用于拌肥处理。

14、在种子包衣处理中，将准备好的菌体在无菌环境下，包裹吸饱水分的玉米种子，播种于无菌蛭石基质；拌肥处理中，将制备好的菌剂添加至无菌蛭石基质中，播种。

15、经过对从水培植物发达的根系表面分离菌落进行纯化和固氮酶活性、产iaa能力、产铁载体能力的检测筛选，共获得一株菌株。

16、菌株鉴定结果：gb-γ菌落是黄色，在低氮液体培养基中，培养过程是淡黄色的液体。genbank中与菌株gb-γ同源性达到99％以上的菌株主要是鞘脂菌(sphingobium sp.)，鞘脂菌(sphingobium amiense、sphingobium mellinum、sphingobium yanoikuyae)与菌株gb-γ序列相似度达100％，所以确定该菌为鞘脂菌，暂定名字为鞘脂菌gb-γ。

17、采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果。

18、具备良好的耐盐属性，且产吲哚乙酸生长素和铁载体的能力都很强，可用于提高作物的固氮能力和耐盐能力，除此之外对植物的生长也有良好的促进作用。

19、下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

技术特征：

1.一种多功能固氮促生菌，其特征在于：该促生菌为鞘脂单胞菌gb-γ，已于2022年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno.25946。

2.一种用于培养多功能固氮促生菌的低氮培养基，其特征在于，培养基包括以下物质：

3.根据权利要求2所述低氮培养基，其特征在于：培养基的ph为7.0，培养箱温度为30℃，培养时间为36-48h。

4.权利要求1所述多功能固氮促生菌的筛选方法，其特征在于：

5.一种多功能固氮促生菌的应用，其特征在于：将权利要求1所述的多功能固氮促生菌用于农作物的促生长。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：在种子包衣处理中，将准备好的菌体在无菌环境下，包裹吸饱水分的玉米种子，播种于无菌蛭石基质。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：拌肥处理中，将制备好的菌剂添加至无菌蛭石基质中，播种。

技术总结
本发明公开了一种多功能固氮促生菌、培养基、筛选及应用，该促生菌为鞘脂单胞菌GB‑γ，已于2022年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.25946。该菌剂为单一菌剂，具备良好的耐盐属性，且产吲哚乙酸生长素和铁载体的能力都很强，可用于提高作物的固氮能力和耐盐能力，除此之外对植物的生长也有良好的促进作用。

技术研发人员：张丽梅,李婷,刘四义
受保护的技术使用者：中国科学院生态环境研究中心
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29