本发明属于生物，具体涉及磷酸酶的突变体及其葡萄糖生物制备方法。
背景技术：
1、葡萄糖是一种能直接吸收利用，补充热能的碳水化合物，是人体所需能量的主要来源。淀粉经人体吸收后，以葡萄糖形式代谢，因此，葡萄糖与人类生存息息相关。葡萄糖也是发酵工业的主要原料，同时葡萄糖在食品加工、工业、饲料、医药等领域也具有广泛的用途。
2、工业化制备葡萄糖主要以淀粉为原料，通过酸水解或者淀粉酶、糖化酶等酶解作用获得。然而随着温室气体过量排放引起全球气候变暖，造成环境恶化，严重影响作物光合作用效率以及淀粉产量；同时随着全球人口激增，有限的可种植土地资源所获得的淀粉等糖质原料渐渐难以满足人类生存所必须，因此有必要开发非土地依赖的糖制备方法。人工转化二氧化碳合成葡萄糖等糖质原料有可能成为未来解决人类温饱以及健康一种有效途径。近年来，围绕人工转化二氧化碳合成碳水化合物渐渐成为研究热点，已有报道建立非生物依赖的催化体系转化二氧化碳合成葡萄糖等单糖分子，但是该方法选择性很低，难以获得单一产物。也有研究开发了电催化-微生物发酵体系，首先将二氧化碳还原为乙酸，随后通过工程化的酵母将乙酸发酵产生葡萄糖，但是由于葡萄糖是细胞的主要能源物质，因此，需要复杂的代谢调控实现，而且转化率低，产量仅为1.8g/l。
3、无论是天然的卡尔文循环还是所设计的人工生物体系，其合成葡萄糖路线中，均首先合成葡萄糖-6-磷酸中间体，再经磷酸酶催化脱磷反应合成葡萄糖，因此催化葡萄糖-6-磷酸生成葡糖糖的磷酸酶是实现合成葡萄糖的关键。然而目前已知的磷酸酶具有底物广谱性，难以获得对葡萄糖-6-磷酸具有较高底物特异性的磷酸酶，因此有必要开发高效的、底物特异性强的磷酸酶元件实现高效转化一碳化合物合成葡萄糖。
技术实现思路
1、本发明通过对来源于thermotoga sp.的磷酸酶进行大量筛选，获得单位点突变的突变体，进一步通过饱和突变获得组合突变，经实验表明，相比野生型而言，特异性和催化活性均明显提升，由此完成本发明。
2、本发明首先提供一种磷酸酶突变体，其对来源于thermotoga sp.的氨基酸序列如seq id no.1所示的磷酸酶的基础上存在下述突变：y122n、y122c、y122w、l18k、l18v、s126d中一个或多个组合。
3、优选地，存在下述突变：y122n/s126d、y122n/s126d/l18v、y122n/s126d/l18k。
4、本发明提供所述突变体的编码基因。优选地，其核苷酸序列在如seq id no.2所示的基础上进行突变而得到。
5、本发明提供含有所述的基因的重组表达载体。具体地，其是原核表达载体，例如是大肠杆菌表达载体。
6、本发明还提供含有所述的编码基因或所述的重组表达载体的重组细胞。具体地，其是原核细胞，例如是大肠杆菌。
7、本发明还提供所述的突变体或所述的编码基因在催化葡萄糖-6-磷酸生成葡糖糖中的应用，具体地催化的反应体系：包括果糖-6-磷酸，葡萄糖磷酸异构酶，mg2+，磷酸盐缓冲液，如权利要求1或2所述的突变体；优选地，其中葡萄糖磷酸异构酶选择来源于thermusthermophilus，其在uniprot上的标号为a3dbx9；磷酸盐缓冲液为50mm，ph 6.5；反应条件：55℃进行催化反应，反应40-90分钟。
8、本发明尤其提供一种体外转化一碳合成葡萄糖，以甲醇为底物，在酶组合的催化下生成葡萄糖，其特征在于，所述酶组合是：甲醇氧化酶，过氧化氢酶，苯甲醛裂解酶，二羟丙酮激酶，磷酸丙糖异构酶，果糖-6-磷酸醛缩酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，以及如权利要求1或2所述的突变体；
9、优选地，甲醇氧化酶为来源于毕赤酵母的ppaox，过氧化氢酶来源于枯草芽孢杆菌的bscat，苯甲醛裂解酶为来源于荧光假单胞菌的苯甲醛裂解酶突变体fls ile28lle/asn283his/thr90leu，二羟丙酮激酶来源于毕赤酵母的ppdhak，磷酸丙糖异构酶来源于escherichia coli的ectpi，和果糖-6-磷酸醛缩酶来源于commensalibacte rsp.esl0284的csfsa，葡萄糖-6-磷酸异构酶来源于escherichia coli的ecpgi；
10、反应体系如下：500mm甲醇，0.75mg/ml ppaox，0.42mg/ml bscat，0.5mm tpp，3.75mg/ml flsm3，2mm atp，0.8mg/ml ppdhak，0.35mg/ml ectpi，0.2mg/ml csfsa，0.1mg/ml pgi，0.2mg/ml g6pp，0.4mg/ml mtppk；
11、具体地，是在30℃反应条件下，反应10-14h。
12、本发明获得的磷酸酶突变体，相比野生型而言，特异性和催化活性均明显提升，可以催化葡萄糖-6-磷酸生成葡糖糖；进而建立的转化一碳制备葡萄糖体系，最终碳转化率超过85％。因此，本发明具有较高的应用价值。
1.一种磷酸酶突变体，其特征在于，对来源于thermotoga sp.的氨基酸序列如seq idno.1所示的磷酸酶的基础上存在下述突变：y122n、y122c、y122w、l18k、l18v、s126d中一个或多个组合。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，存在下述突变：y122n/s126d、y122n/s126d/l18v、y122n/s126d/l18k。
3.权利要求1或2所述突变体的编码基因。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列在如seq id no.2所示的基础上进行突变而得到。
5.含有如权利要求3或4所述的基因的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，其是原核表达载体，例如是大肠杆菌表达载体。
7.含有如权利要求3或4所述的编码基因或如权利要求5或6所述的重组表达载体的重组细胞。
8.如权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，其是原核细胞，例如是大肠杆菌。
9.如权利要求1或2所述的突变体或权利要求3或4所述的编码基因在催化葡萄糖-6-磷酸生成葡糖糖中的应用，具体地催化的反应体系：包括果糖-6-磷酸，葡萄糖磷酸异构酶，mg2+，磷酸盐缓冲液，如权利要求1或2所述的突变体；优选地，其中葡萄糖磷酸异构酶选择来源于thermus thermophilus，其在uniprot上的标号为a3dbx9；磷酸盐缓冲液为50 mm，ph6.5；反应条件：55℃进行催化反应，反应40-90分钟。
10.一种体外转化一碳合成葡萄糖，以甲醇为底物，在酶组合的催化下生成葡萄糖，其特征在于，所述酶组合是：甲醇氧化酶，过氧化氢酶，苯甲醛裂解酶，二羟丙酮激酶，磷酸丙糖异构酶，fsa，葡萄糖-6-磷酸异构酶，以及如权利要求1或2所述的突变体；