一株合成绿原酸的工程菌及其构建方法

本发明属于基因工程，具体涉及一株合成绿原酸的工程菌及其构建方法。

背景技术：

1、绿原酸是由咖啡酸的1位羧酸和奎尼酸的2位羟基缩合成酯的天然产物，是许多中药材的有效成分，具有清除自由基、抗氧化、抗炎症等多种生理活性。也可作为添加剂加入咖啡和口香糖等食品中用于减肥。目前主要通过植物提取获得，但受制于植物种植规模，有效成分低、提取率低以及成本高等问题。新兴的合成生物学技术近年来发展壮大，已有众多天然产物应用微生物细胞工厂合成。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一株合成绿原酸的工程菌及其构建方法。

2、为达到上述目的，具体采用以下技术方案：

3、一种合成绿原酸的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

4、s1:依次克隆羟基肉桂酰辅酶a奎尼酸转移酶突变体基因hqti168l、酪氨酸解氨酶基因tal、抗反馈抑制突变体3-脱氧-d-阿拉伯庚酮酸-7-磷酸合成酶基因arogfbr、抗反馈抑制突变体分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶基因tyrafbr、4-羟基苯乳酸-3-羟化酶基因hpabc至pet24a；

5、s2:依次克隆4-香豆酸辅酶a连接酶基因4cl2、酪氨酸转氨酶基因tyrb、转酮醇酶基因arof至pacycduet-1；

6、s3:依次克隆奎尼酸/莽草酸脱氢酶基因ydib、脱氢奎尼酸合成酶基因arob、3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因tkta至pcdfduet-1；

7、s4：敲除大肠杆菌bl21(de3)的预苯酸脱水酶基因phea和转录调控基因tyrr；

8、s5:将步骤1到步骤s3的表达载体pet24a、pacycduet-1和pacycduet-1共同转化至步骤s4的预苯酸脱水酶基因phea和酪氨酸转录调控基因tyrr双敲除的大肠杆菌bl21(de3)中。

9、进一步地，羟基肉桂酰辅酶a奎尼酸转移酶突变体基因以氨基酸序列为seq idno.1的酶为亲本，将亲本第168位的异亮氨酸突变为亮氨酸，氨基酸序列为seq id no.2。

10、进一步地，羟基肉桂酰辅酶a奎尼酸转移酶基因来源于nicotiana tabacum(genbank:aj582651.1)，4-香豆酸辅酶a连接酶基因来源于arabidopsis thaliana(genbank:aee76480.1)，酪氨酸解氨酶基因来源于rhodotorula taiwanensis(genbank:pjqd01000085.1)，其他基因均来源于大肠杆菌bl21(de3)。

11、一种发酵法合成绿原酸的方法，以葡萄糖或甘油为碳源，在发酵培养基中接入权利要求1所述的微生物细胞。

12、具体过程为：将所述微生物细胞以1-10％的接种量接入发酵培养基中，在30-37℃，ph 6.50-7.00，诱导剂iptg浓度为0.1-1mm，苯丙氨酸浓度为10-100mg/l，培养24-48h。

13、优选地，诱导剂iptg浓度为0.5mm。

14、本发明的有益效果：本发明提供了一株合成绿原酸的工程菌及其构建方法，可以直接利用葡萄糖或甘油等为碳源发酵合成绿原酸，有效降低合成成本，同时提高产量。

技术特征：

1.一种合成绿原酸的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，羟基肉桂酰辅酶a奎尼酸转移酶突变体基因以氨基酸序列为seq id no.1的酶为亲本，将亲本第168位的异亮氨酸突变为亮氨酸，氨基酸序列为seq id no.2。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，羟基肉桂酰辅酶a奎尼酸转移酶基因来源于nicotiana tabacum(genbank:aj582651.1)，4-香豆酸辅酶a连接酶基因来源于arabidopsis thaliana(genbank:aee76480.1)，酪氨酸解氨酶基因来源于rhodotorulataiwanensis(genbank:pjqd01000085.1)，其他基因均来源于大肠杆菌bl21(de3)。

4.一种发酵法合成绿原酸的方法，其特征在于，以葡萄糖或甘油为碳源，在发酵培养基中接入权利要求1所述的微生物细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述微生物细胞以1-10％的接种量接入发酵培养基中，在30-37℃，ph＝6.50-7.00，诱导剂iptg浓度为0.1-1mm，苯丙氨酸浓度为10-100mg/l，培养24-48h。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，诱导剂iptg浓度为0.5mm。

技术总结
本发明公开了一株合成绿原酸的工程菌及其构建方法，通过构建重组菌生物合成绿原酸，所述重组菌同时表达11种酶，分别为羟基肉桂酰辅酶A奎尼酸转移酶突变体，4‑香豆酸辅酶A连接酶，酪氨酸解氨酶，抗反馈抑制突变体3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮酸‑7‑磷酸合成酶，抗反馈抑制突变体分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶，4‑羟基苯乳酸‑3‑羟化酶，酪氨酸转氨酶，奎尼酸/莽草酸脱氢酶，脱氢奎尼酸合成酶，转酮醇酶和3‑脱氧‑7‑磷酸庚酮酸合成酶，重组菌还敲除了预苯酸脱水酶基因和酪氨酸转录调控基因。本发明所述工程菌以葡萄糖或甘油为碳源，可以实现绿原酸的从头合成，摇瓶中发酵产量为331.9mg/L。本发明实现了绿原酸的发酵法合成，有效提升了产量。

技术研发人员：张振宇,储消和,吴杰群,黄书生,柳鹏福
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15