一种针对非洲马瘟病毒VP7蛋白的单克隆抗体及用途

本发明属于免疫学和体外诊断，具体涉及一种针对非洲马瘟病毒vp7蛋白的单克隆抗体及制备方法与用途。

背景技术：

1、非洲马瘟是由非洲马瘟病毒(african horse sickness virus，ahsv)引起马、驴、骡等马属动物的一种非接触性的急性或亚急性传染病。马对非洲马瘟最易感，幼龄马的易感性最高，驴、骡次之，斑马感染后一般无症状，可能是其储存宿主，在该病的传播过程中扮演重要角色。该病主要通过库蠓叮咬传播。非洲马瘟的临床症状可分为4种类型，肺型：潜伏期为3～5天，典型特征表现为呼吸道症状，鼻孔有泡沫样分泌物，可在出现临床症状的数小时内死亡。心型：最初表现为发热，随后出现面颊、眼眶、颈部和胸部等部位水肿，最后心力衰竭而亡。混合型：肺型和心型混和存在，常于死后剖检发现。发热型：临床症状不明显，主要存在于驴和斑马等动物。世界动物卫生组织(woah)将其列为必须通报的疫病，我国将其列为一类动物疫病。

2、非洲马瘟病毒属于呼肠孤病毒科环状病毒属，其基因组由10个大小不同的双链rna片段组成，共编码7种结构蛋白(vp1-vp7)和4种非结构蛋白(ns1-ns4)，其中vp2是血清型特异性抗原，而vp7蛋白是血清群特异性抗原。已发现非洲马瘟病毒至少存在9个血清型，基于vp7蛋白的elisa方法可用于检测非洲马瘟病毒群特异性抗体，适合大规模样品的检测和流行病学调查。

3、目前检测非洲马瘟抗体的方法主要包括竞争elisa、病毒中和试验、琼脂凝胶免疫扩散反应和免疫荧光试验。目前国际上通用的是竞争elisa方法，然而竞争抗体是该试剂盒的关键成分，本发明筛选获得一种针对ahsv vp7蛋白的单克隆抗体及其重链和轻链可变区序列，并利用该抗体作为竞争抗体建立了ahsv竞争elisa抗体检测方法。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明提供了一种针对非洲马瘟病毒vp7蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体具有效价高、亲和力强、特异性好的特点，能够特异性结合非洲马瘟病毒vp7蛋白。具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了一种针对非洲马瘟病毒vp7蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括抗体重链和抗体轻链；

3、所述单克隆抗体重链的可变区cdr包括氨基酸序列如seq id no.5所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.6所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.7所示的cdr3；

4、所述单克隆抗体轻链的可变区cdr包括氨基酸序列如seq id no.8所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.9所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.10所示的cdr3。

5、优选地，所述抗体重链的可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述抗体轻链的可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示。

6、第二方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸编码上述第一方面所述单克隆抗体的抗体重链和抗体轻链。

7、优选地，编码所述抗体重链的可变区的基因序列如seq id no.2所示，编码所述抗体轻链的可变区的基因序列如seq id no.4所示。

8、第三方面，本发明提供了上述第一方面所述的单克隆抗体在制备检测非洲马瘟病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。

9、第四方面，本发明提供了一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：

10、(i)上述第一方面所述的单克隆抗体；

11、(ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或vlp、或其组合。

12、第五方面，本发明提供了一种非洲马瘟病毒elisa检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述第一方面所述的单克隆抗体。

13、优选地，所述试剂盒包括酶标板、非洲马瘟病毒抗原、封闭液、稀释液、权利要求1或2所述的单克隆抗体、酶标二抗、洗涤液、显色剂、终止液。

14、优选地，所述非洲马瘟病毒抗原选自非洲马瘟病毒vp7重组蛋白。

15、优选地，所述封闭液为含5％脱脂奶粉的pbst缓冲液；

16、优选地，所述稀释液为0.01m pbs ph7.2；

17、优选地，所述洗涤液为pbst缓冲液。

18、优选地，所述酶标二抗为hrp标记的山羊抗鼠二抗。

19、第六方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的单克隆抗体在以非疾病诊断为目的非洲马瘟病毒体外检测中的应用。

20、第七方面，本发明提供了一种以非疾病诊断为目的非洲马瘟病毒elisa检测方法，所述方法包括以下步骤：

21、(1)包被：用cbs缓冲液将表达的ahsv vp7重组蛋白稀释为0.5μg/ml，100μl/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜；用pbst缓冲液洗板5次；所述cbs缓冲液为0.05m碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，ph9.6；

22、(2)封闭：用含5％脱脂奶粉的pbst缓冲液封闭酶标板，200μl/孔，37℃孵育1h；用pbst缓冲液洗板5次；

23、(3)检测：将非洲马瘟阳性血清、标准阳性血清和标准阴性血清加入到酶标板内，100μl/孔，37℃孵育1h，用pbst缓冲液洗板5次；

24、(4)然后加入1:2000稀释的上述第一方面所述的单克隆抗体，37℃孵育1h，用pbst缓冲液洗板5次；所述稀释液为0.01m pbs ph7.2；

25、(5)加酶标二抗：将1：40000稀释的hrp标记的山羊抗鼠二抗加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h；用pbst缓冲液洗板5次；所述稀释液为0.01m pbs ph7.2；

26、(6)显色：用tmb显色液避光显色，100μl/孔，37℃孵育10min；加入终止液100μl/孔，读取od450的值；

27、判定方法：阻断率(bp)＝(阴性对照od450-样品od450)/(阴性对照od450-阳性对照od450)×100％；阳性对照小于0.2，阴性对照大于2.0检测方法成立；当bp≤45％时，结果为阴性；当bp≥50％时，结果为阳性；当45％<bp<50％时，结果可疑。

28、本发明的有益效果是：①本发明提供了一种抗非洲马瘟病毒vp7蛋白的单克隆抗体；②免疫印迹试验表明其特异性的和结构蛋白vp7反应；③而且所述单克隆抗体能特异性的与感染细胞中的非洲马瘟病毒结合，能够用于非洲马瘟病毒的检测与诊断；④本发明利用所述单克隆抗体建立了非洲马瘟病毒elisa检测试剂盒及检测方法，相较于现有抗体检测方法，本发明所述方法具有更好的灵敏度和特异性，适用于非洲马瘟病毒的检测与诊断。

技术特征：

1.一种特异性结合非洲马瘟病毒vp7蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括抗体重链和抗体轻链；

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体重链的可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述抗体轻链的可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示。

3.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1或2所述单克隆抗体的抗体重链和抗体轻链。

4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，编码所述抗体重链的可变区的基因序列如seq id no.2所示，编码所述抗体轻链的可变区的基因序列如seq id no.4所示。

5.如权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备检测非洲马瘟病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。

6.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：

7.一种非洲马瘟病毒elisa检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的单克隆抗体。

8.如权利要求7所述的elisa检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶标板、非洲马瘟病毒抗原、封闭液、稀释液、权利要求1或2所述的单克隆抗体、酶标二抗、洗涤液、显色剂、终止液。

9.如权利要求7所述的elisa检测试剂盒，其特征在于，所述非洲马瘟病毒抗原选自非洲马瘟病毒vp7重组蛋白。

10.如权利要求1或2所述的单克隆抗体在以非疾病诊断为目的的非洲马瘟病毒体外检测中的应用。

技术总结
本发明属于免疫学和体外诊断技术领域，具体涉及一种针对非洲马瘟病毒VP7蛋白的单克隆抗体及制备方法。本发明通过将重组表达的非洲马瘟病毒VP7蛋白免疫BALB/c小鼠，筛选获得一种针对非洲马瘟病毒VP7蛋白的单克隆抗体，并通过反转录PCR技术成功获得了编码该株抗体重链及轻链可变区的核苷酸序列。所述单克隆抗体与重组表达的VP7蛋白具有良好的亲和反应能力。利用该单克隆抗体建立了非洲马瘟病毒竞争ELISA抗体检测方法，为有效防控非洲马瘟传入我国提供了技术基础。

技术研发人员：独军政,户鑫兵,徐婧,宋昱庆,王轩莹,田占成,关贵全,罗建勋,殷宏
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15