一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法及应用

本发明属于植物育种，具体涉及一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法及应用。

背景技术：

1、棉花是世界上重要的纤维和油料作物，在我国的经济发展中有着举足轻重的地位。传统的杂交育种法已经难以满足棉花遗传改良的需要，分子水平育种是棉花种质创新的热点。体细胞胚胎发生利用植物细胞全能性重演了合子胚形态发生。而现代分子生物技术的应用大都基于植物的组织培养技术才能取得成功，因此在棉花的新品种选育过程中，组织培养技术变得至关重要。steward和reinert通过悬浮培养的手段对胡萝卜韧皮部细胞进行诱导，并获得了体细胞胚，进一步培养获得了首例再生植株，开启了探索如何使植株再生的新时代。1912年robins通过在培养基中添加不同种类的物质，利用该培养基对棉花的根尖进行培养，获得了缺绿的茎和根，这是首次关于棉花组织培养的报道。

2、棉花组织培养体系的构建起步较晚，但发展迅速。1971年beasiey首次诱导出愈伤组织，price和smith(1979)利用悬浮培养技术成功的诱导出了棉花体细胞胚，1983年davidonis经过长时间的继代培养，成功获得第一株棉花再生植株。张献龙提出棉花的基因型是影响体细胞胚胎发生和植株再生的首要因素。通过对四个栽培品种的比较发现，再生能力高低在栽培种之间也存在较大的差异：陆地棉＞亚洲棉＞海岛棉＞非洲棉；同一栽培种的不同棉花品种间也存在差异，例如陆地棉中，珂字棉＞岱字棉＞斯字棉。历经十几年的研究探索，棉花组织培养体系逐渐完善，随后进入快速发展时期。通过对再生能力相关的基因进行定位和克隆，用以改造农艺价值高但再生能力低的基因型，是实现作物转基因生产的有效手段。

3、有研究表明，鸡脚叶陆地棉品种‘豫早1号’(yz-1)的再生能力强，转化周期短，成苗率高，但是yz-1具有超鸡脚叶，农艺性状差，以其为受体的转基因难以应用在生产实践上。由于棉花体细胞胚胎发生和植株再生对棉花基因型的依懒较大，根据已报道的不同棉花品种的再生培养体系，选择与亲本相关的再生体系对构建的群体进行再生能力进行评估，并尝试定位与体细胞胚发生和再生能力相关的位点，有针对性的将这些位点导入到农艺性状优良的品种中去，可拓宽优良品种作为转基因受体的选择。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供了一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法，包括以下步骤：材料创制→高再生材料筛选→高遗传转化材料筛选，其中所述材料创制包括：以‘鄂棉22’为母本，以‘豫早1号’为父本杂交后，多代自交构建遗传稳定的f9代重组自交系。

2、进一步地，所述高再生材料筛选包括：对所述遗传稳定的f9代重组自交系的无菌苗下胚轴进行愈伤组织诱导、分化出胚和植株再生培养，筛选出高再生材料。

3、进一步地，步骤包括：

4、(1)愈伤组织诱导：采用iba+kt和/或2,4-d+kt两套愈伤组织诱导培养体系，对所述无菌苗下胚轴进行培养；

5、(2)分化出胚：培养得到胚性愈伤组织，对棉花再生能力性状进行统计筛选，得到所述高再生材料；

6、(3)将所述胚性愈伤组织依次接种至分化培养基、生根培养基中，并水培获得再生植株。

7、进一步地，所述棉花再生能力性状包括：愈伤组织诱导率、愈伤组织继代繁殖力、愈伤组织出胚时间、愈伤组织出胚率。

8、进一步地，所述棉花再生能力性状的计算方法为：

9、愈伤组织诱导率：出愈伤块数/诱导愈伤总块数×100％；

10、愈伤组织继代繁殖力：继代25d后的愈伤重-继代0d的愈伤重；

11、愈伤组织出胚时间：单个家系中最早出现胚性愈伤的时间；

12、愈伤组织出胚率：出现胚性愈伤的块数/继代总块数×100％。

13、进一步地，筛选其中愈伤组织诱导率高于98％；愈伤组织继代繁殖力高于4.2g、愈伤组织出胚时间不高于116d、愈伤组织出胚率高于82.4％的家系，得到所述高再生材料。

14、进一步地，所述高遗传转化材料的筛选包括：对所述高再生材料利用农杆菌介导的棉花遗传转化体系，以荧光蛋白为报告基因，获得转基因植株，并筛选得到遗传转化效率不低于80％的转基因家系。

15、进一步地，高遗传转化材料的筛选步骤如下：

16、(1)培养方法的选择，针对在两种体系下均可以再生的家系，采用iba+kt培养体系；只能在ik体系或者dk体系下再生的家系采用ik或者dk体系。

17、(2)培养基的选择，包括无菌苗萌发培养基、农杆菌活化培养基、共培养基、愈伤组织诱导培养基、体细胞胚分化培养基、植株生根培养基；

18、(3)遗传转化效率分析，对每个家系获得的转基因植株，用体式荧光显微镜观察植株中荧光蛋白的表达情况，统计转基因阳性单株，分析遗传转化效率。

19、进一步地，所述步骤还包括：对所述高遗传转化材料的农艺性状进行考察，最终筛选得到农艺性状优良且再生能力和遗传转化效率高的再生材料。

20、本发明的目的还在于提供了一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法在培养陆地棉高效遗传转化受体中的应用。

21、本发明的目的还在于提供了一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法所获得的陆地棉高效遗传转化受体。

22、本发明的目的在于提供了一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法及应用。本发明以湖北省高产阔叶品种‘鄂棉22’(e22)为母本，以高再生能力的鸡脚叶‘豫早1号’(yz-1)为父本杂交后，多代自交构建遗传稳定的f9代重组自交系，利用ik(iba+kt)和dk(2,4-d+kt)两种不同激素组合的培养体系对群体进行再生能力的评估，并对筛选到的高再生阔叶棉进行遗传转化效率鉴定，得到遗传转化效率较高的棉花受体，进一步通过对农艺性状考察，从而可制备得到农艺性状优良且遗传转化效率较高的棉花受体，拓宽了可再生的陆地棉基因型，为棉花遗传转化提供优良受体材料，丰富了目前主流的棉花转基因受体材料。

技术特征：

1.一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：材料创制→高再生材料筛选→高遗传转化材料筛选，其中所述材料创制包括：以‘鄂棉22’为母本，以‘豫早1号’为父本杂交后，多代自交构建遗传稳定的f9代重组自交系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高再生材料筛选包括：对所述遗传稳定的f9代重组自交系的无菌苗下胚轴进行愈伤组织诱导、分化出胚和植株再生培养，筛选出高再生材料。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤包括：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述棉花再生能力性状包括：愈伤组织诱导率、愈伤组织继代繁殖力、愈伤组织出胚时间、愈伤组织出胚率。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述棉花再生能力性状的计算方法为：

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，筛选其中愈伤组织诱导率高于98％；愈伤组织继代繁殖力高于4.2g、愈伤组织出胚时间不高于116d、愈伤组织出胚率高于82.4％的家系，得到所述高再生材料。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高遗传转化材料的筛选包括：对所述高再生材料利用农杆菌介导的棉花遗传转化体系，以荧光蛋白为报告基因，获得转基因植株，并筛选得到遗传转化效率不低于80％的转基因家系。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤还包括：对所述高遗传转化材料的农艺性状进行考察。

9.权利要求1-8任一项所述方法在培育陆地棉高效遗传转化受体材料中的应用。

10.根据权利要求1所述方法获得的陆地棉高效遗传转化受体。

技术总结
本发明公开了一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法及应用，以湖北省高产阔叶品种‘鄂棉22’(E22)为母本，以高再生能力的鸡脚叶‘豫早1号’(YZ‑1)为父本，构建遗传稳定的F<subgt;9</subgt;的重组自交系，利用IK(IBA+KT)和DK(2,4‑D+KT)两种不同激素组合的培养体系对群体进行再生能力的评估，并对筛选到的高再生阔叶棉进行遗传转化效率鉴定以及农艺性状考察，通过该方法最终制备得到了农艺性状优良且遗传转化效率较高的棉花受体，拓宽了可再生的陆地棉基因型，为棉花遗传转化提供优良受体材料，丰富了目前主流的棉花转基因受体材料。

技术研发人员：林忠旭,乐愉,张献龙,王涛
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15