一种发酵法高效生产γ-氨基丁酸的工程菌及其应用的制作方法

：本发明涉及化合物生物技术及发酵工程，尤其是一种生产γ-氨基丁酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

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背景技术：

1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于微生物、动物和植物中，许多生理特性与抗焦虑、低血压镇静剂、利尿剂和止痛剂等相关，还具有介导神经传递和降压的活性，因此被广泛应用于医药、食品、饲料等领域。

2、生物合成反式-4-γ-氨基丁酸的主要途径由谷氨酸脱羧酶(gad)催化l-谷氨酸得到，其具有安全、环保、可持续等优点。现如今，随着人们对γ-氨基丁酸功能研究的逐渐深入，其市场需求还在不断扩大。

3、谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌，并且是一种食品级(gras)微生物，以谷氨酸棒杆菌为底盘细胞进行工业生产γ-氨基丁酸更具有安全性，生产的产品可以广泛应用于食品行业。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种生产γ-氨基丁酸的基因工程菌。

2、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法。

3、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生产γ-氨基丁酸的基因工程菌的应用。

4、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

5、一种高产γ-氨基丁酸的基因工程菌株，为gaba-7，是由下述基因改造策略获得的：以谷氨酸棒杆菌作为底盘菌株，通过在底盘菌中增强谷氨酸脱羧酶、磷酸解酮酶、谷氨酸合酶、和丙酮酸羧化酶的表达，同时降低琥珀酸-半醛脱氢酶、谷氨酸激酶、乳酸脱氢酶的表达获得；

6、进一步地，所述谷氨酸脱羧酶的编码基因gadb1，核苷酸序列如seq id no.1所示；

7、进一步地，所述磷酸解酮酶编码基因xfp，核苷酸序列如seq id no.2所示；

8、进一步地，所述谷氨酸合酶的编码基因cgl0184，核苷酸序列如seq id no.3所示；

9、进一步地，所述丙酮酸羧化酶的编码基因cgl0689，核苷酸序列如seq id no.4所示；

10、进一步地，所述除琥珀酸-半醛脱氢酶的编码基因cgl0051，核苷酸序列如seq idno.5所示；

11、进一步地，所述谷氨酸激酶的关键基因cgl2356，核苷酸序列如seq id no.6所示；

12、进一步地，所述乳酸脱氢酶的编码基因cgl2911，核苷酸序列如seq id no.7所示；

13、优选地，所述底盘菌株为谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum)atcc13032；

14、更进一步地，增强谷氨酸脱羧酶表达的方式为：整合两拷贝的谷氨酸脱羧酶编码基因gadb1；

15、更进一步地，增强磷酸解酮酶表达的方式为：整合一拷贝磷酸磷酸解酮酶编码基因xfp，减少碳流失；

16、更进一步地，增强谷氨酸合酶表达的方式为：整合一拷贝的谷氨酸合酶编码基因cgl0184，增强前体物质谷氨酸的生物合成；

17、更进一步地，增强丙酮酸羧化酶表达的方式为：将丙酮酸羧化酶编码基因cgl0689的原始启动子替换为ptuf启动子，增强流入tca循环中的碳流量；所述ptuf启动子，核苷酸序列如seq id no.8所示；

18、更进一步地，降低琥珀酸-半醛脱氢酶表达的方式为：敲除琥珀酸-半醛脱氢酶基因cgl0051，阻断gaba的分解途径；

19、更进一步地，降低谷氨酸激酶表达的方式为：敲除谷氨酸激酶关键基因cgl2356，减少谷氨酸分解代谢；

20、更进一步地，降低乳酸脱氢酶的表达方式为：敲除乳酸脱氢酶基因cgl2911，阻断丙酮酸分解途径。

21、上述基因工程菌在发酵生产γ-氨基丁酸中的应用；

22、进一步地，采用上述基因工程菌发酵生产γ-氨基丁酸的方法如下：

23、(1)斜面活化：将生产菌株从-80℃的20％甘油保菌管接入斜面活化培养，培养条件为32℃、12h；

24、(2)一级种子摇瓶：32℃，ph 7.0，220rpm，摇床培养10h；

25、(3)发酵罐二级种子：一级种子液接入发酵罐内进行二级种子培养，32℃，ph 7.0，溶氧40％，培养至od600达到40；

26、(4)发酵罐发酵培养：接种量20％，32℃，溶氧40％，培养30-50h；

27、进一步地，种子培养基为：葡萄糖25g/l，玉米浆干粉15g/l，豆粕水解液15ml/l，k2hpo4·3h2o 1.0g/l，mgso4·7h2o 1.0g/l，其余为水。

28、进一步地，发酵培养基的组成为：葡萄糖60g/l，kh2po4 3g/l，mgso4·7h2o 2g/l，mnso4·h2o 20mg/l，feso4 20mg/l，vb1 0.5mg/l，vh 0.1mg/l，酵母粉7g/l，蛋氨酸0.5g/l，玉米浆干粉20g/l，豆粕水解液30ml/l，消泡剂2滴，其余为水，ph 7.0；

29、进一步地，发酵培养基中添加0-40mg/l的plp(磷酸吡哆醛)；

30、5l发酵罐，发酵40h，产量可高达59.4g/l。

31、有益效果：

32、本发明构建的生产γ-氨基丁酸的基因工程菌，为高产γ-氨基丁酸的基因工程菌gaba-7。该基因工程菌以葡萄糖等为底物，从头合成价值更高的γ-氨基丁酸，发酵40h产量可高达59.4g/l，目前处于国内领先水平。与现有γ-氨基丁酸生产菌相比，该基因工程菌具有遗传稳定性好、遗传背景清晰、可持续改造等优点，无需添加谷氨酸为底物，节约了生产成本，适合规模化工业生产的需要。

技术特征：

1.一种基因工程菌株，其特征在于，是以谷氨酸棒杆菌作为底盘菌株，通过在底盘菌中增强谷氨酸脱羧酶、磷酸解酮酶、谷氨酸合酶、和丙酮酸羧化酶的表达，同时降低琥珀酸-半醛脱氢酶、谷氨酸激酶、乳酸脱氢酶的表达获得。

2.如权利要求1所述的一种基因工程菌株，其特征在于，所述底盘菌株为谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum)atcc13032。

3.如权利要求1所述的一种基因工程菌株，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的编码基因gadb1，核苷酸序列如seq id no.1所示；

4.如权利要求1所述的一种基因工程菌株，其特征在于，增强谷氨酸脱羧酶表达的方式为：整合两拷贝的谷氨酸脱羧酶编码基因gadb1；增强磷酸解酮酶表达的方式为：整合一拷贝磷酸磷酸解酮酶编码基因xfp；增强谷氨酸合酶表达的方式为：整合一拷贝的谷氨酸合酶编码基因cgl0184；增强丙酮酸羧化酶表达的方式为：将丙酮酸羧化酶编码基因cgl0689的原始启动子替换为ptuf启动子；

5.权利要求1-4任意一项所述基因工程菌株在生产γ-氨基丁酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵罐生产γ-氨基丁酸的方法如下：种子液按20％接种量接入发酵培养基，32℃，溶氧40％，发酵培养30-50h。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵培养基的组成为：葡萄糖60g/l，kh2po43g/l，mgso4·7h2o 2g/l，mnso4·h2o 20mg/l，feso4 20mg/l，vb1 0.5mg/l，vh 0.1mg/l，酵母粉7g/l，蛋氨酸0.5g/l，玉米浆干粉20g/l，豆粕水解液30ml/l，消泡剂2滴，其余为水，ph 7.0。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵培养基中添加0-40mg/l的磷酸吡哆醛。

技术总结
本发明涉及化合物生物技术及发酵工程技术领域，尤其是一种生产γ‑氨基丁酸的基因工程菌及其构建方法与应用。所述工程菌是以谷氨酸棒杆菌作为底盘菌株，通过在底盘菌中增强谷氨酸脱羧酶、磷酸解酮酶、谷氨酸合酶、和丙酮酸羧化酶的表达，同时降低琥珀酸‑半醛脱氢酶、谷氨酸激酶、乳酸脱氢酶的表达获得。本发明构建的生产γ‑氨基丁酸的基因工程菌，能够以葡萄糖等为底物，从头合成价值更高的γ‑氨基丁酸，发酵40h产量可高达59.4g/L，目前处于国内领先水平。与现有γ‑氨基丁酸生产菌相比，该基因工程菌具有遗传稳定性好、遗传背景清晰、可持续改造等优点，无需添加谷氨酸为底物，节约了生产成本，适合规模化工业生产的需要。

技术研发人员：王震,刘醒,马洪坤,王晓雷,纪召艳,肖雨停,段增坤,杨晓琳
受保护的技术使用者：天津世纪伟康生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15