一种从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法及其应用与流程

本发明涉及生物技术的，尤其是涉及一种从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法及其应用。

背景技术：

1、多聚脱氧核糖核苷酸，是大分子dna降解后的小片段的产物，长度介于数十到数千碱基对，脱氧核糖核苷酸有4种：腺嘌呤脱氧核糖核苷(a)、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(g)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(t)和胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(c)，dna分子结构则由两股反向互补的多脱氧核糖核苷酸链，a-t、g-c间以氢键形成碱基配对，形成稳定的双股螺旋结构，功能性pn/pdrn的长度介于50到2000碱基对；目前已知ppdrn的长度决定其生物功能性，对序列则没有特定要求。

2、自1952年mastelli公司首次对pdrn的药理活性进行研究以来，pdrn能够加速dna的合成，作为皮肤天然的保护剂和修复剂，具有的防晒、消炎、促进细胞再生、组织修复、促进伤口愈合、减少疤痕生成、祛皱等美容修复功效逐渐被人熟知，被广泛用于美容产品中，例如，placentex-pdrn具有伤口治疗、骨骼软组织再生的功效，pdrn能够缩短皮肤代谢周期，使皮肤回到白嫩、光滑、富有弹性的婴儿皮肤状态，pdrn婴儿针现已成为女性美容市场的火热产品，普丽兰婴儿针的分子量为700kd，属于医疗器械级别的大分子物质，适用于皮肤再生。

3、pdrn主要提取自人类或哺乳类动物的胎盘组织：大西洋鲑鱼的精细胞即精囊组织、虹鳟鱼的精细胞即精囊组织、太平洋鲑鱼的精细胞即精囊组织或是中华鲟的精细胞即精囊组织，现有由从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法部分步骤操作复杂，且在获取的过程中需要使用超声波、na打断仪进行分子破碎或是长时间的高速离心处理等操作，部分环节手法不够温和，容易损伤提取物，且容易造成不必要的浪费，降低了pdrn的提取效率。

技术实现思路

1、根据现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法及其应用，具有方法温和，操作简便，提取率高的效果。

2、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

3、一种从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法，包括以下步骤：

4、1)、新鲜的鱼类精巢进行血管剔除及组织破碎；

5、2)、将破碎后的鱼类精巢加入dna提取缓冲液中搅拌均匀；

6、3)、提取缓冲液中加入蛋白酶酶解和sds溶液水浴加热，并搅拌；

7、4)、提取缓冲液进行4℃离心处理，弃掉沉淀收集上清液；

8、5)、上清液与饱和氯化钠水溶液进行混匀，进行4℃离心收集上清液；

9、6)、离心获取的上清液加入预冷的无水乙醇中进行沉淀，收集沉淀；

10、7)、用75％乙醇清洗沉淀3次并冻干处理获得pdrn；

11、8)、利用分光光度计检验pdrn水溶液纯度(260nm/280nm)为1.8-2.0；

12、优选的，所述步骤1中鱼类可以选用鲑科、太平洋鲑属的大马哈鱼，且鱼精巢预处理：新鲜的鱼精巢取出后，剔除其上附着的血管，冲洗两遍后进行组织破碎，匀浆处理。

13、优选的，dna提取缓冲液，主要是tris-hcl、氯化钠、edta二钠混合溶液，且按照料液比1：2的比例将破碎后的鱼类精巢加入含tris-hcl、氯化钠、edta二钠混合盐溶液中，搅拌均匀。

14、优选的，步骤3中酶解所用的酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶k或枯草杆菌蛋白酶中的一种，所述蛋白酶k与精巢的质量比为1：25000，且10％sds溶液与缓冲液体积比为1:50，水浴加热温度范围为37-65℃，搅拌时间24h。

15、优选的，步骤4中离心处理的离心机转速为10000r/min，离心处理时间为30min。

16、优选的，将步骤4收集的上清液与饱和氯化钠溶液2:1的比例混合，搅拌均匀后进行4℃离心收集上清液，离心机转速10000r/min，时间设置30min。

17、优选的，预冷无水乙醇进行dna沉淀为，步骤5中获取的上清液与预冷的无水乙醇按照体积比1:1的比例进行dna沉淀，并收集沉淀。

18、优选的，将步骤6中收集到的沉淀，加入预冷的75％的乙醇中进行洗涤，离心3次，收集沉淀，并对沉淀进行冻干处理。

19、优选的，将步骤7获取的pdrn取样进行溶解，利用紫外分光光度计测定260nm和280nm的od值，计算od260nm/od280nm比值，比值在1.8-2.0范围即可。

20、另一方面，本发明提供一种根据所述方法从鱼类精巢获取pdrn及利用所述pdrn而制造的医药品或化妆品。

21、本发明具有以下有益效果：

22、本发明能够提供一种从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法，步骤较少操作简单，在进行pdrn获取过程中提取手法相对温和，且过程安全可靠，pdrn提取效率高，获取的pdrn纯度较高，且色泽亮白。

技术特征：

1.一种从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法，其特征在于，

2.根据权利要求1所述的从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法，其特征在于：所述步骤1中的鱼类可选用鲑科、太平洋鲑属的大马哈鱼。

3.根据权利要求1所述的从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法，其特征在于：所述步骤2中dna提取缓冲液，主要是tris-hcl、氯化钠、edta二钠混合溶液，且破碎后的鱼类精巢与dna提取缓冲液的料液比为1:2。

4.根据权利要求1所述的从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法，其特征在于：步骤3中酶解所用的酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶k或枯草杆菌蛋白酶中的一种，且其中蛋白酶k与精巢的质量比为1：25000，10％sds溶液与缓冲液体积比为1:50，水浴加热温度范围为37-65℃，搅拌时间24h。

5.根据权利要求1所述的从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法，其特征在于：步骤4离心处理中离心机转速为10000r/min，且离心处理时间为30min。

6.根据权利要求1所述的从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法，其特征在于：步骤6中上清液与预冷的无水乙醇的体积比为1:1。

7.根据权利要求1-6任一项所述的从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法从鱼类精巢获取的pdrn。

8.一种利用权利要求7所述的pdrn制造的医药品或化妆品。

技术总结
本发明涉及一种从鱼类精巢获取多脱氧核糖核苷酸方法，包括以下步骤：1)、新鲜的鱼类精巢进行血管剔除及组织破碎；2)、将破碎后的鱼类精巢加入DNA提取缓冲液中搅拌均匀；3)、提取缓冲液中加入蛋白酶酶解和SDS溶液水浴加热，并搅拌；4)、提取缓冲液进行4℃离心处理，弃掉沉淀收集上清液；5)、上清液与饱和氯化钠水溶液进行混匀，进行4℃离心收集上清液；6)、离心获取的上清液加入预冷的无水乙醇中进行沉淀，收集沉淀。本发明方法步骤较少操作简单，在进行PDRN获取过程中提取手法相对温和，且过程安全可靠，PDRN提取效率高，获取的PDRN纯度较高，且色泽亮白。

技术研发人员：吴中英,赵云瑛,李俊丽,汲康,姜新颖
受保护的技术使用者：威海联创海洋生物技术研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/8/20